الكشف عن الجسيمات الفيروسية SARS-CoV-2 في طاف خلية Vero E6 المصاب بفيروس SARS-CoV-2

ابدأ بخلط الكازين وكحول البولي فينيل والبولي فينيل بيروليدون و BSA مع الرقم الهيدروجيني سبعة لتحضير مخزن المقايسة. بعد ذلك ، قم بإعداد 10٪ من الغلوبولين المناعي للأرانب G في محلول الفحص لجعل المخزن المؤقت لتخفيف العينة. تحضير حجم خليط حبة العمل اللازمة للاختبار.

ثم قم بإذابة SARS-CoV-2 المحضر والتحكم في المواد الطافية عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بتسمية وترتيب ثمانية أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر لكل منها ل SARS-CoV-2 والتحكم في المواد الطافية. لإنشاء أعلى تخفيف لكل مادة طافية ، ادمج 600 ميكرولتر من المادة الطافية مع المخزن المؤقت لتخفيف العينة في أنابيب تحمل علامات مناسبة ، متبوعة بدوامة الأنبوب لفترة وجيزة للخلط.

نقل 400 ميكرولتر بالتتابع من واحد إلى طاف مخفف واحد إلى أنبوب التخفيف التالي. دوامة لفترة وجيزة كل طاف مخفف قبل الشروع في التخفيف التالي. ثم خذ خليط حبة العمل المعد مسبقا بعد الدوامة لمدة 30 ثانية وأضف خمسة ميكرولترات إلى كل بئر مخصص للوحة عيار ميكرو مسطحة القاع 384 بئرا.

أضف 45 ميكرولترا من التخفيف الطافي المحضر إلى الآبار المخصصة التي تحتوي على كرات مجهرية في لوحة 384 بئرا. أغلق اللوحة واحتضانها طوال الليل على شاكر مداري عند 650 دورة في الدقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة لوحة المعايرة الدقيقة من شاكر المداري ، قم بطرد اللوحة عند 931 جم لمدة دقيقة واحدة.

ثم قم بإزالة لوحة السداده. لشل حركة الخرز ، ضع لوحة المعايرة الدقيقة على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة 30 ثانية. مع استمرار وضع لوحة المعايرة الدقيقة على الفاصل المغناطيسي ، قم بنضح المادة الطافية من حبات المغناطيس الثابتة.

بعد إزالة لوحة العيار الدقيق من الفاصل المغناطيسي ، أضف 60 ميكرولترا من PBST إلى كل بئر تحتوي على حبة. بعد ذلك ، خذ خمسة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر لإعداد خلطات كشف مختلفة. أضف جسما مضادا أحادي النسيلة بشريا مضادا ل S1 وشظايا متغيرة أحادية السلسلة تحمل علامة FLAG تستهدف بروتين سبايك على جسيم SARS-CoV-2 إلى كل أنبوب.

أضف 50 ميكرولترا لكل بئر من مزيج الكشف عن السنبلة المناسب أحادي السلسلة والمتغير الخاص بالشظايا إلى الكرات المجهرية المغسولة. أغلق لوحة العيار الدقيق واحتضانها كما هو موضح سابقا. ثم أجهزة الطرد المركزي لوحة microtiter.

اغسل كاشف الكشف عن السنبلة الزائدة من الخرز باستخدام 60 ميكرولتر من PBST ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول فلوري يتكون من الغلوبولين المناعي G المترافق والمضاد للإنسان مع البنفسج اللامع ل 21 جسما مضادا مترافقا مضادا ل FLAG. أضف 50 ميكرولترا لكل بئر من مزيج محلول الفلورسنت إلى الكريات المجهرية المغسولة ، واحتضانها كما هو موضح سابقا.

ثم تدور أسفل لوحة microtiter. اغسل مزيج محلول الفلورسنت الزائد من الكريات المجهرية ب 60 ميكرولترا من PBST. قم بتعليق الكريات المجهرية في 60 ميكرولتر من PBST من خطوة الغسيل الأخيرة.

ثم قم بتحليل اللوحة على نظام تحليل تدفق المراسل المزدوج بالإعدادات المطلوبة. في تخفيف طافات الخلايا المصابة بفيروس SARS-CoV-2 في كلتا قناتي المراسل ، لوحظت إشارة تعتمد على التركيز. يمكن لثلاثة من أصل خمسة شظايا متغيرة أحادية السلسلة اكتشاف الفيروس في تخفيف منخفض يصل إلى واحد إلى 18.

بالنسبة للشظيتين المتبقيتين من سلسلة واحدة ، يمكن اكتشاف الفيروس في التخفيفات التي تصل إلى واحد إلى ستة.