قبل توصيل الأنبوب المعقم بالرقاقة الحيوية ، اغسل الأنبوب أولا ب 200 ميكرولتر من PBS متبوعا ب 200 ميكرولتر من وسط EC. بعد شطف الغرفة العلوية والسفلية بوسط زراعة الخلايا المعد حديثا ، أدخل الخزان على جانب مخرج الرقاقة الحيوية وقم بتوصيل الخزان بالأنبوب بمدخل الرقاقة الحيوية. للحصول على وفرة متوسطة دائرية ، قم بتوصيل الأنبوب بالخزان والرقاقة الحيوية.
الآن املأ الخزان ب 500 ميكرولتر من وسط EC. قم بتوصيل الرقاقة الحيوية بالأنبوب لبدء الوفرة بمعدل تدفق 21 ميكرولتر في الدقيقة. في اليوم التالي ، أوقف الوفرة وأفرغ الخزانات.
تحت خزانة أمان معقمة ، ماصة 500 ميكرولتر من وسط EC في الخزانات واغسل الغرفة السفلية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من RPMI plus medium. ثم أعد تشغيل التروية بمعدل تدفق 21 ميكرولتر في الدقيقة. لإنشاء واجهة سائل هواء من اليوم 12 إلى اليوم 14 ، افتح المقابس الموجودة في الغرفة السفلية وامتصاص الوسيط بعناية حتى تظهر فقاعة هواء.
بعد التأكد من إزالة جميع السوائل من القناة والغرفة ، أغلق المنافذ بعناية ، واملأ الخزان بوسط EC الوعائي الطازج واستمر في ثقافة الوفرة فقط في الغرفة العلوية حتى اليوم 14. افصل الرقائق الحيوية عن نظام التدفق. بعد إزالة الأنبوب ، افحص طبقات الخلايا من الرقاقة الحيوية تحت المجهر لالتقاء الخلية.
اغسل تجاويف الرقائق الحيوية باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة وسط زراعة الخلايا. أضف 300 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد 4٪ في PBS إلى الغرفة العلوية و 200 ميكرولتر إلى الغرفة السفلية. بعد 10 دقائق من الحضانة ، اغسل الغرفة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
للنفاذية ، أضف 300 ميكرولتر من 0.25٪ Triton X 100 في PBS واحتضانها لمدة 30 دقيقة ، بعد الغسيل باستخدام PBS ، ماصة 300 ميكرولتر من 3٪ ألبومين مصل البقر في PBS في كلتا الغرفتين واحتضانها لمدة ساعة واحدة. للتلطيخ المناعي ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من محاليل الأجسام المضادة باستخدام 3٪ BSA لكل غشاء باستخدام نسب التخفيف المناسبة. للوصول إلى الخلايا الموجودة داخل الرقاقة الحيوية ، قم بإجراء قطع دقيق عبر الجزء الخارجي من التجويف وإزالة رقائق الترابط.
باستخدام مشرط ، اقطع الغشاء عن طريق إزالة الحواف المختومة على الرقاقة الحيوية. بعد تقسيم الغشاء إلى قطعتين ، اجمع قطع الغشاء بملقط وضعها على شريحة مجهرية للتلطيخ ، أضف 50 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة لكل قطعة غشاء واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، للحماية من الضوء. بعد غسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBS ، أضف قطرة من وسيط التثبيت على الشريحة المسماة وضع الغشاء المقابل.
أضف قطرة من وسيط التثبيت في الجزء العلوي من الغشاء ، وضع غطاء زجاجي. كشف تلطيخ التألق المناعي للخلايا البطانية للوريد السري البشري عن تغيرات مورفولوجية وتعبير البروتين الماركوبروتين بعد 14 يوما من الثقافة المشتركة. على الجانب الوعائي ، اقترح التعبير المتماسك V عند حدود الخلايا البطانية التقاء وتشكيل حاجز بطاني.
تم تقييم الجانب الظهاري للإيكاهيرين والبروتين الخافض للتوتر السطحي تعبير يشير إلى سلامة ووظيفة الظهارة السنخية.
