للبدء ، التقط العينات المذابة من أنسجة الفئران المصابة بالسالمونيلا باستخدام زوج من الملقط. أدخله بسرعة في قاع قالب بلاستيكي يحتوي على أغاروز سائل. بمجرد اكتمال البلمرة ، استخدم مشرطا لفتح القالب البلاستيكي من الزوايا.
بعد وضع شفرة على ميكروتوم ، انقل العينة بأصابع قفاز إلى صندوق عينة. ضع العينة تحت الميكروتوم بحيث يكون السطح العلوي للأغاروز في نفس مستوى شفرة الميكروتوم. حرك المسرح لوضع مكعب الأغاروز في مركز الهدف.
انقر فوق الزر Slice في برنامج التصوير المقطعي حتى يتم الحصول على شريحة سليمة كاملة من المكعب. بعد ذلك ، قم بتوسيط العدسة الشيئية على عينة الأنسجة في الاتجاهين x و y. قم بتشغيل برنامج الليزر ، واضبط الطول الموجي على 800 نانومتر ، ثم قم بتشغيل الليزر.
أغلق أبواب خزانة المجهر. ثم أطفئ جميع مصادر الإضاءة في الغرفة. قم بتشغيل PMTs واضبط الجهد على 750 فولت.
الآن اضبط مصراع المجهر على تلقائي. ثم اضبط الفولتية من V1 و V2 على 20 و 1.71 على التوالي. اضبط المحور z بجهاز z-piezo حتى يصل إلى سطح الأنسجة.
قطع شرائح متعددة بسمك 50 ميكرومتر. بعد ذلك ، للعثور على حواف العينة ، احصر منطقة التصوير في الأنسجة مع الحد الأدنى من تصوير الأغاروز المحيط. بعد إيقاف تشغيل PMTs ، اضبط الطول الموجي لليزر على 800 نانومتر.
استخدم بقعة الليزر للعثور على إحداثيات حواف الأنسجة أثناء تحريك المرحلة. بعد التأكد من الإحداثيات ، ضع بقعة الليزر في المركز الأمامي الأيمن. الآن قم بتغيير الطول الموجي إلى 940 نانومتر.
اضبط مصراع المجهر على الوضع التلقائي ، ثم اضبط جهد الغالق على 20 ل V1 و 1.71 ل V2. اضغط على خيار إعداد 3D Mosaic لبدء المسح. بعد التصوير ، اجمع أقسام الأنسجة من خزان المياه. لدمج صور التجانب ، قم أولا بنقل البيانات من خادم التصوير المقطعي إلى كمبيوتر Linux.
افتح البرنامج النصي MATLAB StepOneStitchAndArchive. م وحدد موقع المجلد المصدر. قم بالتبديل إلى علامة التبويب محرر وانقر فوق تشغيل.
سيتم عرض معلومات التقدم في نافذة الأوامر. ابحث عن الصور المخيطة في المجلد الفرعي المسمى stitchedimages_100 في المجلد المصدر. ضغط البيانات الأولية باستخدام الأمر tar ، واحفظها كملف واحد بامتداد اسم الملف tar.bz2.
لتدريب آلة متجه الدعم ، قم بمعاينة الصور المخيطة. افتح صورة واحدة بنفس اسم الملف من كل مجلد فرعي مع فيجي. ادمج القنوات الثلاث في صورة ملونة واحدة ، ثم اضبط سطوع كل قناة حتى تظهر إشارات واضحة من البكتيريا والتألق الذاتي للأنسجة.
لاحظ الحد الأقصى لمستوى الكثافة المعدل لكل قناة. بعد ذلك ، افتح البرنامج النصي MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m. حدد المجلد المصدر وأسماء الصور للتدريب ، ثم انتقل إلى علامة التبويب محرر وانقر فوق تشغيل.
عندما يظهر مربع حوار يطلب عتبات اللون ، املأه بالقيم بناء على الفحص اليدوي السابق مع فيجي. حدد المناطق للخلفية ومناطق الاهتمام وفقا لمربعات الحوار. ستظهر الرسوم البيانية التي توضح مدى جودة تدريب النموذج ، وتسأل عما إذا كانت هناك حاجة إلى إضافة المزيد من المناطق.
أضف المزيد من مناطق الاهتمام والخلفية حتى يمكن تقسيم البكتيريا بوضوح. سيتم تشغيل عملية التجزئة تلقائيا ، ويمكن رؤية التقدم في نافذة الأوامر. بعد ذلك ، افتح صور القناة الزرقاء ، والتي تحتوي على إشارات توافقية ثانية للكولاجين.
قم بثني صور القناة الأولى عشرة أضعاف في كل من المحورين x و y واحفظ الصور التي تم تصغيرها في مجلد جديد. قم بعمل ثلاث نسخ متماثلة من الصور المصغرة داخل نفس المجلد. للتصور 3D إطلاق حزمة برامج التصور Imaris في عرض الساحة.
افتح الآن ملف IMS أو TIF. اضبط تمثيلات الألوان للقنوات المختلفة في نافذة ضبط العرض. انقر فوق خصائص الصورة ضمن قائمة تحرير لتعيين الحد الأدنى أو الحد الأقصى للقيم وقيمة تصحيح جاما يدويا.
بعد ضبط مظهر الصورة ، قم بتصدير العرض الحالي باستخدام أداة اللقطة. استخدم مؤشر التنقل للعثور على طريقة عرض، ثم استخدم علامة الجمع إضافة لإضافة إطارات رئيسية. استخدم رمز الرسوم المتحركة لتمثيل بيانات 3D كفيلم.
اضغط على زر التسجيل الأحمر لإنشاء الفيلم ، ثم احفظه في مجلد الوجهة ونوع الملف المطلوبين. تم اكتشاف خلايا السالمونيلا الفردية في أعضاء الفئران بأكملها ، مثل الطحال والكبد والغدد الليمفاوية المساريقية وبقع باير. تم تأكيد تجزئة البكتيريا الفلورية بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية.
تم تلطيخ الخلايا المضيفة في الجسم الحي عن طريق حقن جسم مضاد لعلامات السطح قبل التروية.
