ابدأ بنقل خلايا HEK 293 T. بعد ثلاثة أيام من النقل ، قم بإزالة الوسائط من الآبار واغسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 500 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر.
احتضان لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل جميع الخلايا من اللوحة. ثم أضف 500 ميكرولتر من وسائط DMEM الكاملة إلى كل بئر وأعد تعليق الخلايا. نقل جميع الخلايا من كل بئر إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.
ثم أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقتين في 1،000 غرام في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب وغسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني واحد ملليلتر. مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.
نقل الخلايا إلى أنابيب FACS. فحص الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي. قم بتحميل تعليق الخلية غير المستأصل.
في ورقة عمل قياس التدفق الخلوي ، اضغط على الحصول على وضبط الفولتية المبعثرة الأمامية والجانبية. لوضع الخلايا في المنطقة الوسطى ، قم ببوابة حول هذه المجموعة R1 لاستبعاد الحطام في الربع الأيسر السفلي. قم بتغيير بوابة FL1 ، FL2 بقعة بقعة ك G R1. حدد أداة البوابات الرباعية وانقر على الطرف العلوي الأيمن من عدد الخلايا في لطخة النقطة FL1 / FL2 ك G R1. اضبط الفولتية FL1 / FL2 لوضع الخلايا في الربع السفلي الأيسر.
اضغط على إيقاف مؤقت وإحباط. ثم قم بتحميل خلايا التحكم أحادية اللون GFP. اضغط على اكتساب وضبط التعويض لوضع الخلايا الموجبة ل GFP في الربع الأيمن السفلي.
اضغط على إيقاف مؤقت وإحباط. بعد ذلك ، قم بتحميل خلايا التحكم أحادية اللون mChere. اضغط على اكتساب واضبط التعويض لوضع الخلايا الموجبة mCherry في الربع الأيسر العلوي.
اضغط على إيقاف مؤقت وإحباط. انقر فوق اكتساب على شريط القائمة وحدد تخزين الاكتساب. ضمن معايير التجميع، حدد سيتوقف الاستحواذ عند حساب 10،000 من أحداث G1 R1.
قم بإلغاء علامة اختيار الإعداد. قم بتحميل خلايا العينة. اضغط على اكتساب وانتظر حتى يتم حساب 10،000 خلية G1 R1.
كرر نفس الشيء مع العينات وعناصر التحكم الأخرى.
