تحليل الانضمام النهائي غير المتماثل وكفاءة إعادة التركيب المتماثل في خلايا HEK-293T باستخدام أنظمة مراسل قائمة على GFP

تمثل فواصل الحمض النووي المزدوجة أكثر آفات الحمض النووي خطورة. ردا على ذلك ، تستخدم الخلايا آليتين أساسيتين لإصلاح كسر الحمض النووي المزدوج ، NHEJ و HR. يعد القياس الكمي لكفاءة NHEJ والموارد البشرية بشكل منفصل أمرا بالغ الأهمية لاستكشاف الآليات والعوامل ذات الصلة المرتبطة بها. مقايسة NHEJ ومقايسة الموارد البشرية هي طرق راسخة تستخدم لقياس كفاءة NHEJ والموارد البشرية. تعتمد هذه الطرق على البلازميدات المصممة بدقة والتي تحتوي على جين بروتين الفلورسنت الأخضر المعطل مع مواقع التعرف على نوكلياز I-SceI لتحريض DSBs.

يمكن إجراء اختبار NHEJ وفحص الموارد البشرية باستخدام نهج متكامل الكروموسومات أو خارج الكروموسومات. يتيح النهج المتكامل للكروموسومات تحليل إصلاح DSB ضمن مسابقة كروموسومية. ومع ذلك ، فإن النهج المتكامل للكروموسومات يتطلب خلية طويلة وغير مناسب للدراسات المقارنة التي تنطوي على خطوط خلايا متعددة.

في هذا البروتوكول ، نصف فحوصات NHEJ و HR خارج الكروموسومات التي تتضمن انتقالا عابرا لبلازميدات GFP و I-SceI المعطلة إلى خلايا HEK-293T وتحليل قياس التدفق الخلوي اللاحق. تم استخدام فحوصات المراسلين غير المتكاملة هذه لتقييم كفاءة NHEJ وكفاءة الموارد البشرية من قبل العديد من المختبرات ، بما في ذلك مختبرنا. على عكس النهج المتكامل للكروموسومات ، يتيح هذا النهج خارج الكروموسومات التحليل السريع لكفاءة NHEJ أو HR من خلال استخدام خطوط الخلايا المستقرة والمستقرة.