تصوير النشاط على مستوى الخلية المفردة في الفئران حديثي الولادة باستخدام المجهر ثنائي الفوتون

للبدء ، قم بتثبيت مقياس الزوايا ثنائي المحور مع لوحة التيتانيوم على لوحة المرحلة لتحديد المواقع XY تحت المجهر. قم بتنشيط برنامج المسح الضوئي ، واضبط وحدات البكسل على 512 × 512 ثنائية الاتجاه على استخدام عدسة موضوعية 20X. بعد إجراء جراحة نافذة الجمجمة ، ضع الجرو الذي يعبر عن GCaMP على جانب واحد من نصف الكرة على وسادة التدفئة.

باستخدام البراغي ، قم بتثبيت قضيب التيتانيوم المثبت على الرأس بلوحة التيتانيوم. ثم اضبط زاوية النافذة أفقيا باستخدام مقياس الجونيوم. قم بإضاءة سطح الدماغ بالإضاءة الخلفية وحدد منطقة التصوير باستخدام تحديد موضع XY باستخدام عدسة موضوعية 5X.

تحت عدسة الغمر بالماء 20X ، قم بتطبيق قطرات العين على نافذة الجمجمة. بعد تعطيل الإضاءة الخلفية ، قم بمسح سطح الدماغ في وضع فوتون واحد. زيادة كثافة الليزر لتصور التألق الذاتي الأخضر من الزجاج وسطح الدماغ.

قم بتغطية المجهر لمنع تداخل الضوء الخارجي. ابدأ تشغيل برنامج المسح الضوئي إلى وضعين للفوتونات للتصوير. ثم قم بمعايرة طاقة الليزر وكسب الكاشف لتصور إشارات GCaMP على النحو الأمثل.

حدد موقع العمق في منطقة تصوير مليئة بالعديد من الخلايا العصبية المعبرة عن GCaMP وابدأ التصوير بفاصل زمني لالتقاط إشارات GCaMP. كشف الفحص المجهري ثنائي الفوتون عن أنشطة الخلايا العصبية من الطبقة الرابعة في القشرة البرميلية لجرو اليوم السادس بعد الولادة مع مضان أخضر. كان GCaMP الأخضر أكثر بروزا ، مما أدى إلى تسرب الإشارة إلى القناة الحمراء وتحديد 14 منطقة ذات أهمية.