تنقيط الخلية البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) لمنصة الأوعية على لوحة (VOP)

للبدء ، اغمر قارورة من HUVECs المحفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة لمدة دقيقتين. ثم شطف القارورة مع 70 ٪ من الإيثانول لمنع التلوث. ماصة خمسة ملليلتر من ECGM قبل تسخينها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.

باستخدام ماصة صغيرة ، انقل الخلايا المذابة بعناية من القارورة إلى الأنبوب المخروطي. ثم أضف ملليلتر واحد من الوسط الطازج الذي تم تسخينه مسبقا إلى cryovial لشطف الداخل ونقل أي خلايا متبقية إلى الأنبوب المخروطي. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من الوسط الطازج.

ثم انقل الخلايا إلى قارورة T75. احتضان القارورة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطب عند 37 درجة مئوية. شطف 90٪ من خلايا HUVEC المتقاربة في دورق T75 مع 10 ملليلتر من DPBS.

ثم أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ TE إلى القارورة. بعد الحضانة ، اضغط برفق على جوانب القارورة وأضف خمسة ملليلتر من محلول تحييد التربسين. ثم نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.

جمع الخلايا المتبقية مع خمسة ملليلتر من ECGM الطازجة ونقلها إلى أنبوب مخروطي. الآن الطرد المركزي الأنبوب المخروطي في 250 × غرام لمدة ثلاث دقائق لجمع بيليه الخلية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من ECGM الطازج وعد الخلايا.

بعد الطرد المركزي مرة أخرى ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 90 ميكرولترا من ECGM الطازج. بعد ذلك ، قم بشفط قنوات الأوعية المطبوعة على لوحة بالمكنسة الكهربائية لفترة وجيزة لتنظيف التجويف. باستخدام ماصة صغيرة ، قم بتحميل القناة برفق ب 15 ميكرولترا من تعليق خلية HUVEC.

ضع اللوحة بشكل مسطح داخل حاضنة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، اقلب اللوحة إلى 180 درجة ، مع الحفاظ عليها في وضع مسطح لمدة الساعتين القادمتين. بعد أربع ساعات ، اغسل القناة باستخدام DPBS لإزالة الخلايا غير الملتصقة والميتة.

ثم ماصة ملليلتر من ECGM الطازجة في كل بئر. ضع الثقافة الديناميكية على الروك بزاوية إمالة 10 درجات وخمس دورات في الدقيقة. تلتصق خلايا HUVEC بسرعة وتتكاثر لتغطية السطح اللمعي للقنوات الوعائية ل VOP.

تم التحقق من نضوج البطانة عن طريق التلوين المناعي ل CD31 بعد 5 أيام من بذر الخلايا ، مما أظهر توطين CD31 عند التقاطعات الضيقة.