عزل كسور الميتوكوندريا المخصبة من مزارع الخلايا وعينات الأنسجة الحيوانية الصغيرة لفحوصات نشاط الهلام

للبدء ، أعد تعليق حبيبات الخلية المعبأة في حجم من المخزن المؤقت منخفض التوتر يساوي سبعة أضعاف حجم حبيبات الخلية. انقل تعليق الخلية إلى خالط Potter-Dounce ، واحتضانه على الجليد لمدة دقيقتين ، مما يسمح للخلايا بالانتفاخ. كسر أغشية الخلايا عن طريق إجراء 8 إلى 10 ضربات في الخالط مقترنة بمدقة تفلون مدفوعة بمحرك تدور بسرعة 600 دورة في الدقيقة.

أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت مفرط التوتر إلى تعليق الخلية لتوليد بيئة متساوية التوتر. انقل التجانس إلى أنبوب من 10 إلى 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي عند 1،000G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وجمع المادة الطافية في أنبوب البولي بروبلين 1.5 ملليلتر.

لجمع الجزء الخام من الميتوكوندريا ، قم بطرد مركزي في جهاز ميكروفوج عند 16،000 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات المخصبة بالميتوكوندريا مع 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت A.دمج محتويات أنبوبين في واحد وأجهزة طرد مركزي كما هو موضح سابقا. بعد الطرد المركزي الأخير ، أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A.Quantify تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة برادفورد.

باستخدام المقص ، وقطع 20 إلى 30 ملليغرام من الأنسجة الحيوانية. اغسل المنديل ثلاث إلى أربع مرات في محلول التجانس بمساعدة مصفاة ، مع الحرص على تجنب فقدان القطع الصغيرة. نقل قطع الأنسجة مع العازلة إلى الخالط.

بالنسبة لأنسجة الكبد والطحال والكلى ، قم بإجراء أربع إلى ست ضربات لأعلى ولأسفل في LVM Potter باستخدام مدقة تفلون تعمل بمحرك عند 600 دورة في الدقيقة.