تم دعم هذا العمل من خلال المنحة رقم "PGC2018-095795-B-I00" من وزارة العلوم والابتكار (https://ciencia.sede.gob.es/) والمنح "Grupo de Referencia: E35_17R" والمنحة رقم "LMP220_21" من Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) إلى PF-S و RM-L.

تجزئة الميتوكوندريا في عينات الأنسجة الصغيرة لتحليل فائق التعقيد

<ol>
	<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li><li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes.">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li><li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+respiratory+supercomplexes:+the+plasticity+model.">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li><li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes.">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes.">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li><li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes.">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes.">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).</li><li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly,+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain.">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li><li>Moreno-Loshuertos, R., Fern&#225;ndez-Silva, P., Ostojic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li><li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells:+structural+versus+functional+role.">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li><li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes.">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases.">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li><li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system:+implications+for+pathology.">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).</li><li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex.">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li><li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition.">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li><li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients.">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li><li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondria+in+heart+failure:+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation.">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li><li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases.">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).</li><li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism.">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li><li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+supercomplexes:+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders.">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).</li><li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging.">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li><li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer.">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).</li><li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance.">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).</li><li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer.">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).</li><li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells.">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).</li><li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+hot+can+mitochondria+be?+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria.">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li><li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane.">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li><li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1.">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li><li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV.">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li><li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity.">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452 (2011).</li><li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle:+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity.">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).</li><li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes.">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells:+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers.">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li><li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants.">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Vizarra, E., Fern&#225;ndez-Silva, P., Enr&#237;quez, J. A., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).</li><li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enr&#237;quez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page.">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تهدف التعديلات المنهجية التي تم إدخالها في البروتوكولات الموصوفة هنا إلى تجنب الخسائر وزيادة الغلة مع الحفاظ على الأنشطة المعقدة للميتوكوندريا (وهو أمر بالغ الأهمية عندما يتعرض توافر كميات كافية من العينات للخطر) وإعادة إنتاج النمط المتوقع للأنسجة أو خط الخلية من SCs (انظر الش?...

المجمعات الفائقة (SCs) هي ارتباطات فوق جزيئية بين مجمعات السلسلة التنفسية الفردية 1,2. منذ التحديد الأولي للطوائف المنبوذة ووصف تكوينها من قبل مجموعة Schägger 2,3 ، والتي أكدتها لاحقا مجموعات أخرى ، ثبت أنها تحتوي على مجمعات تنفسية I و III و IV (CI ، CIII ، و CIV ، على التوالي) في مقاييس متكافئة مختلفة. يمكن تعريف مجموعتين رئيسيتين من SCs ، تلك التي تحتوي على CII (وإما CIII وحدها أو CIII و CIV) وذات وزن جزيئي مرتفع جدا (MW ، بدءا من ~ 1.5 MDa ل SC الأصغر: CI + CIII2) وتلك التي تحتوي على CIII و CIV ولكن ليس CI ، مع حجم أصغر بكثير (مثل CIII2 + CIV مع ~ 680 كيلو دالتون). تتعايش هذه SCs في غشاء الميتوكوندريا الداخلي مع مجمعات حرة ، أيضا بنسب مختلفة. وهكذا ، في حين أن CI موجود في الغالب في الأشكال المرتبطة به (أي في SCs: ~ 80٪ في قلب الأبقار وأكثر من 90٪ في العديد من أنواع الخلايا البشرية)3 ، فإن CIV وفيرة جدا في شكلها الحر (أكثر من 80٪ في قلب الأبقار) ، مع CIII يظهر توزيعا أكثر توازنا (~ 40٪ في شكله الحر الأكثر وفرة ، كدايمر ، في قلب الأبقار).
في حين أن وجودها مقبول الآن بشكل عام ، إلا أن دورها الدقيق لا يزال قيد النقاش4،5،6،7،8،9،10. وفقا لنموذج اللدونة ، يمكن أن توجد نسب مختلفة من SCs والمجمعات الفردية اعتمادا على نوع الخلية أو الحالة الأيضية1،7،11. هذه الطبيعة الديناميكية للتجميع ستسمح للخلايا بتنظيم استخدام الوقود المتاح وكفاءة نظام الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) استجابة للتغيرات البيئية4،5،7. يمكن أن تساهم SCs أيضا في التحكم في معدل توليد أنواع الأكسجين التفاعلية والمشاركة في تثبيت ودوران المجمعات الفردية4،12،13،14. تم وصف تعديلات حالة تجميع SC بالاقتران مع الحالات الفسيولوجية والمرضية المختلفة15,16 ومع عملية الشيخوخة17.
وهكذا ، تم وصف التغيرات في أنماط SC في الخميرة اعتمادا على مصدر الكربون المستخدم للنمو2 وفي خلايا الثدييات المستزرعة عندما يتم استبدال الجلوكوز بالجالاكتوز4. كما تم الإبلاغ عن تعديلات في كبد الفأر بعد الصيام8 وفي الخلايا النجمية عندما يتم حظر أكسدة الأحماض الدهنية الميتوكوندريا18. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على انخفاض أو تغيرات في SCs و OXPHOS في متلازمة بارث19 ، وفشل القلب20 ، والعديد من الاضطرابات الأيضية21 والعصبية22،23،24 ، وأورام مختلفة25،26،27،28. ما إذا كانت هذه التغييرات في تجميع SC ومستوياته هي السبب الرئيسي أو تمثل آثارا ثانوية في هذه الحالات المرضية لا تزال قيد التحقيق15,16. ويمكن أن توفر المنهجيات المختلفة معلومات عن تجميع الطوائف المنبوذة ووظيفتها؛ وتشمل هذه قياسات النشاط8،29 ، وتحليل البنية التحتية30،31 ، والبروتينات32،33. البديل المفيد الذي يتم استخدامه بشكل متزايد وهو نقطة البداية لبعض المنهجيات المذكورة سابقا هو التحديد المباشر لحالة تجميع SC بواسطة الرحلان الكهربائي الأزرق الأصلي (BN) الذي طورته مجموعة Schägger34,35 لهذا الغرض.
يتطلب هذا النهج إجراءات قابلة للتكرار وفعالة للحصول على أغشية الميتوكوندريا وإذابتها ويمكن استكمالها بتقنيات أخرى مثل تحليل النشاط داخل الهلام (IGA) ، والرحلان الكهربائي للبعد الثاني ، واللطخة الغربية (WB). يمكن أن يكون أحد القيود في الدراسات حول ديناميكيات SC بواسطة الرحلان الكهربائي BN هو كمية خلايا البدء أو عينات الأنسجة. نقدم سلسلة من البروتوكولات لتحليل تجميع SC ووظيفته ، مقتبسة من طرق مجموعة Schägger ، والتي يمكن تطبيقها على عينات الخلايا أو الأنسجة الطازجة أو المجمدة بدءا من 20 مجم من الأنسجة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic acid</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis Tris</td>
			<td>Acrons Organics</td>
			<td>327721000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue G-250</td>
			<td>Serva</td>
			<td>17524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue R-250</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1125530025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamino&#160; benzidine (DAB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acids free BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10775835001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>A1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Teflon pestle</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>196102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>121512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>121509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Labkem</td>
			<td>MTOL-P0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTCO1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN1001BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Running Buffer (20x)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDUFA9 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium salt (NBT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pb(NO3)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>228621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDVF Membrane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>10600023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenazine methasulfate (PMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PMSF-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDHA Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin/penicillin</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UQCRC1 Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>459140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mitochondria for mitochondrial supercomplex analysis from small tissue and cell culture samples 

على مدى العقود الماضية ، غيرت الأدلة المتراكمة حول وجود مجمعات الجهاز التنفسي (SCs) فهمنا لتنظيم سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا ، مما أدى إلى اقتراح "نموذج اللدونة". يفترض هذا النموذج التعايش بين نسب مختلفة من SCs والمجمعات اعتمادا على الأنسجة أو حالة التمثيل الغذائي الخلوي. ستسمح الطبيعة الديناميكية للتجميع في SCs للخلايا بتحسين استخدام الوقود المتاح وكفاءة نقل الإلكترون ، وتقليل توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وتفضيل قدرة الخلايا على التكيف مع التغيرات البيئية. 
في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن تشوهات في تجميع SC في أمراض مختلفة مثل الاضطرابات التنكسية العصبية (مرض الزهايمر ومرض باركنسون) أو متلازمة بارث أو متلازمة لي أو السرطان. لا يزال دور تعديلات تجميع SC في تطور المرض بحاجة إلى تأكيد. ومع ذلك، فإن توافر كميات كافية من العينات لتحديد حالة تجميع اللجنة العليا غالبا ما يشكل تحديا. يحدث هذا مع الخزعة أو عينات الأنسجة الصغيرة أو التي يجب تقسيمها لإجراء تحليلات متعددة ، مع مزارع الخلايا ذات النمو البطيء أو تأتي من أجهزة الموائع الدقيقة ، مع بعض الثقافات الأولية أو الخلايا النادرة ، أو عندما يجب تحليل تأثير علاجات مكلفة معينة (مع الجسيمات النانوية ، والمركبات باهظة الثمن ، وما إلى ذلك). في هذه الحالات ، يلزم وجود طريقة فعالة وسهلة التطبيق. تقدم هذه الورقة طريقة تم تكييفها للحصول على كسور الميتوكوندريا المخصبة من كميات صغيرة من الخلايا أو الأنسجة لتحليل بنية ووظيفة SCs الميتوكوندريا عن طريق الرحلان الكهربائي الأصلي متبوعا بمقايسات نشاط الهلام أو اللطخة الغربية.

Supercomplexes (SCs) are supramolecular associations between individual respiratory chain complexes1,2. Since the initial identification of SCs and the description of their composition by the group of Sch&#228;gger2,3, later confirmed by other groups, it was established that they contain respiratory complexes I, III, and IV (CI, CIII, and CIV, respectively) in different stoichiometries. Two main populations of SCs can be defined, those containing CI (and either CIII alone or CIII and CIV) and with very high molecular weight (MW, starting ~1.5 MDa for the smaller SC: CI + CIII2) and those containing CIII and CIV but not CI, with much smaller size (such as CIII2 + CIV with ~680 kDa). These SCs coexist in the inner mitochondrial membrane with free complexes, also in different proportions. Thus, while CI is mostly found in its associated forms (that is, in SCs: ~80% in bovine heart and more than 90% in many human cell types)3, CIV is very abundant in its free form (more than 80% in bovine heart), with CIII showing a more balanced distribution (~40% in its more abundant free form, as a dimer, in bovine heart).
While their existence is now generally accepted, their precise role is still under debate4,5,6,7,8,9,10. According to the plasticity model, different proportions of SCs and individual complexes can exist depending on the cell type or the metabolic status1,7,11. This dynamic nature of the assembly would allow cells to regulate the use of available fuels and the efficiency of the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system in response to environmental changes4,5,7. SCs could also contribute to control the reactive oxygen species generation rate and participate in the stabilization and turnover of individual complexes4,12,13,14. Modifications of the SC assembly status have been described in association with different physiological and pathological situations15,16 and with the aging process17.
Thus, changes in the SC patterns have been described in yeast depending on the carbon source used for growth2&#160;and in cultured mammalian cells when glucose is substituted by galactose4. Modifications have also been reported in mouse liver after fasting8 and in astrocytes when mitochondrial fatty acid oxidation is blocked18. In addition, a decrease or alterations in SCs and OXPHOS have been found in Barth syndrome19, heart failure20, several metabolic21 and neurological22,23,24 disorders, and different tumors25,26,27,28. Whether these alterations in SC assembly and levels are a primary cause or represent secondary effects in these pathological situations is still under investigation15,16. Different methodologies can give information about the assembly and function of SCs; these include activity measurements8,29, ultrastructural analysis30,31, and proteomics32,33. A useful alternative that is increasingly being employed and is the starting point for some of the previously mentioned methodologies is the direct determination of SC assembly status by Blue native (BN) electrophoresis developed for this purpose by Sch&#228;gger&#39;s group34,35.
This approach requires reproducible and efficient procedures to obtain and solubilize mitochondrial membranes and can be complemented by other techniques such as in-gel activity analysis (IGA), second-dimension electrophoresis, and western blot (WB). A limitation in the studies on SC dynamics by BN electrophoresis can be the amount of starting cells or tissue samples. We present a series of protocols for the analysis of SC assembly and function, adapted from Sch&#228;gger&#39;s group methods, that can be applied to fresh or frozen cell or tissue samples starting from as little as 20 mg of tissue.

تسليط الضوء على المؤلف: كشف النقاب عن ديناميكيات نظام الفسفرة التأكسدية وأدوار الميتوكوندريا في الصحة والمرض

عزل الميتوكوندريا لتحليل الميتوكوندريا فائقة التعقيد من عينات زراعة الأنسجة والخلايا الصغيرة 

Our research is focused on better understanding mitochondrial biogenesis, in particular, the OXPHOS System organization and Regulation, and also on defining the role that mitochondria play in diseases from cancer to neurodegenerative disorders. Mitochondria perform multiple and essential roles in the cell, conditioning its whole metabolism and survival. We're slowly increasing our knowledge of mitochondrial complexity, and its contribution to cell adaptation mechanisms in health and disease.We have contributed to establish a new organization model for the OXPHOS system, the plasticity model that integrates previous proposals and assumes the coexistence of super complexes and free complexes in different proportions to optimize its function and allow cellular adaptations. Our protocol allows starting from small tissues or cell culture samples to obtain enough mitochondrial protein amounts to analyze super complexes assembly and status and function by blue native electrophoresis or other techniques. We can do this reproducibly in a short time with a simple equipment and relatively with low costs.

تختلف غلة الميتوكوندريا التي يتم الحصول عليها باتباع البروتوكولات الموصوفة أعلاه اعتمادا على عدة عوامل مثل خط الخلية أو نوع الأنسجة ، أو طبيعة العينات (أي إذا تم استخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة) ، أو كفاءة عملية التجانس. يتم جمع الغلة المتوقعة من الميتوكوندريا من خطوط الخلايا والأنسجة...

Read this Scientific Article Protocol about Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول تقنية لتحليل المعقدات التنفسية الفائقة عندما تتوفر كميات صغيرة فقط من العينات.

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

يركز بحثنا على فهم التكوين الحيوي للميتوكوندريا بشكل أفضل ، على وجه الخصوص ، تنظيم وتنظيم نظام OXPHOS ، وكذلك على تحديد الدور الذي تلعبه الميتوكوندريا في الأمراض من السرطان إلى الاضطرابات التنكسية العصبية. تؤدي الميتوكوندريا أدوارا متعددة وأساسية في الخلية ، حيث تقوم بتكييف عملية التمثيل الغذائي والبقاء على قيد الحياة بالكامل. نحن نزيد ببطء معرفتنا بتعقيد الميتوكوندريا ، ومساهمتها في آليات تكيف الخلايا في الصحة والمرض.لقد ساهمنا في إنشاء نموذج تنظيمي جديد لنظام OXPHOS ، نموذج اللدونة الذي يدمج المقترحات السابقة ويفترض التعايش بين المجمعات الفائقة والمجمعات الحرة بنسب مختلفة لتحسين وظيفتها والسماح بالتكيفات الخلوية. يسمح بروتوكولنا بالبدء من الأنسجة الصغيرة أو عينات زراعة الخلايا للحصول على كميات كافية من بروتين الميتوكوندريا لتحليل تجميع المجمعات الفائقة وحالتها ووظيفتها عن طريق الرحلان الكهربائي الأزرق الأصلي أو تقنيات أخرى. يمكننا القيام بذلك بشكل متكرر في وقت قصير باستخدام معدات بسيطة وبتكاليف منخفضة نسبيا.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples 

643 Views.  University of Zaragoza. يركز بحثنا على فهم التكوين الحيوي للميتوكوندريا بشكل أفضل ، على وجه الخصوص ، تنظيم وتنظيم نظام OXPHOS ، وكذلك على تحديد الدور الذي تلعبه الميتوكوندريا في الأمراض من السرطان إلى الاضطرابات التنكسية العصبية. تؤدي الميتوكوندريا أدوارا متعددة وأساسية في الخلية ، حيث تقوم بتكييف...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: كشف النقاب عن ديناميكيات نظام الفسفرة التأكسدية وأدوار الميتوكوندريا في الصحة والمرض

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial electron transport chain organization, giving rise to the proposal of the "plasticity model." This model postulates the coexistence of different proportions of SCs and complexes depending on the tissue or the cellular metabolic status. The dynamic nature of the assembly in SCs would allow cells to optimize the use of available fuels and the efficiency of electron transfer, minimizing reactive oxygen species generation and favoring the ability of cells to adapt to environmental changes. 
More recently, abnormalities in SC assembly have been reported in different diseases such as neurodegenerative disorders (Alzheimer's and Parkinson's disease), Barth Syndrome, Leigh syndrome, or cancer. The role of SC assembly alterations in disease progression still needs to be confirmed. Nevertheless, the availability of enough amounts of samples to determine the SC assembly status is often a challenge. This happens with biopsy or tissue samples that are small or have to be divided for multiple analyses, with cell cultures that have slow growth or come from microfluidic devices, with some primary cultures or rare cells, or when the effect of particular costly treatments has to be analyzed (with nanoparticles, very expensive compounds, etc.). In these cases, an efficient and easy-to-apply method is required. This paper presents a method adapted to obtain enriched mitochondrial fractions from small amounts of cells or tissues to analyze the structure and function of mitochondrial SCs by native electrophoresis followed by in-gel activity assays or western blot.

This protocol describes a technique for the analysis of respiratory supercomplexes when only small amounts of samples are available.