للبدء ، احصل على ماوس SMARTA إيجابي CD 45.1 يبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع وقم بحقنه ب 200 ميكروغرام من الببتيد LCMV GP 61-77 في 100 ميكرولتر من وسط RPMI عن طريق الوريد. بعد الحصول على الخلايا الطحالية من الفأر ، قم بتعليقها في 2٪ RPMI لتحقيق كثافة خلية واحدة في 10 إلى خلايا eighT لكل ملليلتر ووضع الأنبوب مع الخلايا على الجليد. قم بتوزيع 50 ميكرولترا من تعليق الخلية مع 150 ميكرولترا من محلول التلوين لكل بئر من صفيحة 96 بئرا مستديرة القاع.
أجهزة الطرد المركزي لوحة 96 بئر عند 800 غرام لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية وصب بعناية طاف . دوامة اللوحة وإضافة 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ إلى كل بئر. بعد تكوير الخلايا ، أعد تعليقها واحتضانها بكوكتيل الأجسام المضادة السطحية على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
بعد الغسيل مرتين ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ ونقلها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي للتحقق من حالة تنشيط الخلايا التائية الإيجابية SMARTA CD4. ثم زرع مرة واحدة في 10 الخلايا التائية الموجبة الستة SMARTA CD4 لكل بئر في صفيحة بئر 24.
قم بتدوير الخلايا عند 800 جم لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة الوسط الطافي بعناية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسط الفيروس القهقري وثمانية ميكروغرام من البوليبرين إلى كل بئر. تدور الخلايا عند 800 غرام لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
بعد التخلص من وسط الفيروس القهقري ، احتضان الخلايا بملليلتر واحد من 10٪ RPMI المسخن مسبقا المكمل بالإنترلوكين 2. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر والطرد المركزي عليه. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا بنسبة 2٪ RPMI لتحقيق كثافة خلية واحدة في 10 إلى ثماني خلايا لكل ملليلتر.
لتقييم كفاءة النقل ، قم بتخصيص 50 ميكرولترا من تعليق الخلية في لوحة مستديرة القاع 96 بئرا. احتضنهم على الجليد مع كوكتيل الأجسام المضادة السطحية بما في ذلك CD4 و V alpha two والجسم المضاد المرتبط بعلامة المتجهات. اغسل الخلايا وقم بإجراء قياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا.
ثم قم بحقن مرة واحدة في 10 من الخلايا التائية الإيجابية الستة CD 45.1 SMARTA CD4 إلى ماوس متلقي C57BL / 6 عن طريق الوريد متبوعا بواحد في 10 إلى وحدات تشكيل اللويحات الست من LCMV Armstrong في اليوم التالي. بعد الحصول على الخلايا الطحالية من الماوس ، وصمة عار لهم للتحقق من العلامات المطلوبة. للكشف عن عوامل النسخ ، احتضان الخلايا مع 200 ميكرولتر من 2 ٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
أخيرا ، قم بإجراء قياس التدفق الخلوي للكشف عن العوامل في مرحلة الإصابة الحادة المبكرة ب LCMV. في اليوم الثالث بعد الإصابة ، تم العثور على تشعب متوازن للخلايا التائية المساعدة الجريبية والخلايا التائية المساعدة 1 بين الخلايا التائية الإيجابية MIGR1 SMARTA CD4. لوحظ تمايز موجه للخلايا التائية المساعدة الجريبية السائدة ومستويات تعبير BCL6 محسنة في الخلايا التائية الإيجابية MIGR1 BCL6 SMARTA CD4.
