لمراقبة التوطين تحت الخلوي ل GFP ، بعد 48 ساعة من التسلل الزراعي ل Nicotiana benthamiana ، حدد ورقة مسطحة وقم بعمل ثقب بطول ستة ملليمترات باستخدام ثقب ثقب. يقطر 30٪ محلول السكروز على شريحة زجاجية. ضع عينة الورقة بحيث يكون الظهر متجها لأعلى ، وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي.
اجمع أوراق N.benthamiana الطازجة السليمة التي تعبر عن GFP المؤتلف في ثلاثة أيام بعد التسلل الزراعي ، وقم بوزن الأوراق. شطف شفرة ورقة بالماء المبرد مسبقا ، معقم ، مقطر مزدوج لإزالة الحطام. اغمر 20 جراما بحيث يكون الجانب المحوري لأسفل في 500 ملليلتر من محلول فوسفات 100 مليمولار المبرد مسبقا في دورق عريض الفم سعة 1،000 ملليلتر.
غطي الأوراق ب 100 شبكة نايلون وخيوط شبكية دقيقة وصفيحة بلاستيكية. قم بتوصيل الدورق بمضخة تفريغ. ضع فراغ 0.8 ميجاباسكال لمدة دقيقة واحدة ، ثم استعد الضغط الجوي بسرعة.
قم بإزالة الأوراق من المخزن المؤقت وجففها برفق بورق ماص. نشمر الأوراق ولفها بخيوط شبكية. لجمع سائل الغسيل اللدائن ، أو AWF ، يترك الأوراق المدرفلة في الموضع جانبا لأعلى في أنابيب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر مع خيوط شبكية مثبتة بواسطة أغطية الأنابيب.
الطرد المركزي الأوراق في 500g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. إزالة الأوراق وجمع AWF باستخدام ماصة. أضف راتنج النيكل سيفاروز إكسل إلى أنبوب بنسبة واحد إلى 1،000 بالنسبة إلى حجم مستخلص البروتين.
اغسل راتنج النيكل ثلاث مرات مع 10 أضعاف حجم الراتنج من الماء المقطر المزدوج وعازلة الفوسفات بشكل منفصل ، بدوره. احتضان مستخلص البروتين مع راتنج النيكل لمدة ساعتين للسماح بالربط الكامل. ثم ، أجهزة الطرد المركزي في 500g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة البروتينات غير المرتبطة في طف.
اغسل ثلاث مرات مع 20 ضعف حجم الراتنج من العازلة الفوسفات. بعد الغسيل الأخير ، أضف 10 أضعاف حجم الراتنج البالغ 250 مللي مولار إيميدازول للتخلص من GFPs. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 500g لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وجمع طاف.
أكد تحليل اللطخة الغربية التعبير العابر ل 30 كيلودالتون بروتين مؤتلف GFPs في N.benthamiana. أوضح الفحص المجهري الفلوري وجود GFPs داخل apoplast. كما احتوت بروتينات AWF المستخرجة بواسطة الطرد المركزي للتسلل الفراغي على GFPs.
من بين محاليل الاستخراج الثمانية التي تم اختبارها ، استخرج المخزن المؤقت للفوسفات أكبر كمية من AWF و GFPs. كشفت مقارنة المخزن المؤقت للفوسفات عند درجة حموضة متفاوتة عن تحسن استخراج AWF و GFPs في ظروف محايدة إلى قلوية معتدلة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر 100 مليمول فوسفات عازلة أقصى فعالية لاستعادة AWF و GFPs.
باستخدام مخزن فوسفات 100 مليمولار ، تم استرداد 495 ميكروغرام من إجمالي بروتينات AWF لكل جرام من الأوراق الطازجة من apoplast. احتوى AWF المستخرج على 10 ميكروغرام من GFPs ، والتي تتوافق مع حوالي 18 ٪ من GFPs في البروتين الكلي القابل للذوبان. بعد كروماتوغرافيا تقارب النيكل ، وصلت نقاء GFPs إلى 84.3٪ من استخراج AWF ، وهي أعلى بكثير من نقاء 44.9٪ الذي تم تحقيقه من خلال استخراج البروتين الكلي القابل للذوبان.
