ابدأ بطلاء المصفوفة خارج الخلية على إدراج ثقافة الخلية لثقافة أحادية الطبقة 2D المشتقة من المواد العضوية. ضع 100 ميكرولتر من طلاء المصفوفة خارج الخلية على الغرفة القمية لكل إدراج ثقافة خلية محضرة واستبدل الغطاء. ثم احتضان لوحة ثقافة الخلية في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.
بالنسبة للخلايا العضوية المستقيمية ، بعد الحضانة ، استبدل طلاء المصفوفة خارج الخلية بوسط ثقافة أحادية الطبقة المستقيم واحتضان بين عشية وضحاها. بعد الهضم الأنزيمي للعضويات والترشيح إلى الخلايا المفردة ، قم بالطرد المركزي تعليق الخلية عند 200 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ثم تخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بإعداد 200 ميكرولتر من معلقات الخلية لكل إدراج ثقافة الخلية في وسائط الثقافة أحادية الطبقة.
استرجع لوحة زراعة خلايا البئر المكونة من 24 والتي تحتوي على إدخالات ثقافة خلية مغلفة بالمصفوفة خارج الخلية. باستخدام الشفط الفراغي ، أفرغ بعناية الغرفة القمية لكل ملحق مزرعة خلية لتجنب تعطيل الطلاء. ضع بعناية 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المفردة على الغرفة القمية لكل إدراج ثقافة خلية.
أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع أحادي الطبقة المكمل بشكل مناسب إلى الغرفة القاعدية لكل بئر. ثم احتضان اللوحة في حاضنة رطبة لتعزيز التصاق الخلايا ونموها ، وتشكيل طبقة أحادية 2D متقاربة على إدراج ثقافة الخلية. قم بتغيير وسط الاستزراع في كل من الغرف القمية والقاعدية كل يوم ، بدءا من 48 ساعة بعد بذر الخلية.
لتلطيخ المناعة من أحادية الطبقة 2D المشتقة من العضوية ، قم بقطع غشاء إدراج ثقافة الخلية بعناية بشفرة مشرط ووضع إدراج ثقافة الخلية على شريحة زجاجية. أضف وسائط التثبيت على قسيمة الغطاء وضعها على الشريحة الزجاجية قبل مراقبة الخلايا. بعد يوم واحد من بذر المواد العضوية الناضجة المنفصلة على إدراج ثقافة الخلية ، بدا أن طبقة أحادية 2D تتشكل.
كشف المجهر الإلكتروني الماسح عن وجود زغابات دقيقة متطورة وترسيم خلوي على السطح القمي للطبقة الأحادية 2D بعد خمسة أيام من البذر. أكد التلوين المناعي للطبقات أحادية 2D وجود حدود الفرشاة القمية ، وتقاطعات الالتصاق القاعدي ، وخلايا الكأس المنتجة للمخاط في كل من الطبقات أحادية العضوية المشتقة من اللفائفي والمستقيم.
