للبدء ، احصل على أجنة الزرد المخدرة في المخزن المؤقت E3. بعد اختيار الأجنة ذات التألق المطلوب ، تصور نبضات قلبها تحت مجهر ستيريو مشرق المجال. باستخدام ماصة نقل عريضة الطرف ، ارسم ما يصل إلى ثلاثة أجنة ، وانقلها إلى لوحة تصوير زجاجية سفلية.
تحت مجهر ستيريو ، باستخدام ماصة ، استبدل الوسط حول الأجنة بمحلول أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1٪. باستخدام طرف بلاستيكي رفيع مدبب متصل بإبرة إغاظة ، ادفع كل جنين برفق إلى أسفل لوحة التصوير ، وقم بتوجيه الجانب الظهري لمواجهة الزجاج. قم بتركيب الجنين في مجهر متحد البؤر مقلوب.
بعد تعيين معلمات اكتساب الفاصل الزمني ، احصل على الصور. افتح برنامج محول ملفات Imaris ، واسحب الملفات وأفلتها في منطقة الإدخال. في قائمة الإخراج ، حدد موقع الملفات المحولة.
انقر فوق حجم voxel المحدد للتحقق ، واضغط على ابدأ الكل زر لبدء تحويل الملف إلى تنسيق IMS. بمجرد إطلاقه ، دع برنامج التحليل يبدأ في الساحة. انقر فوق مجلد المراقبة لفتح الملف المحول مسبقا.
بمجرد تحميل الملف في البرنامج ، انقر فوق عرض الشريحة للتمرير عبر z-stack. باستخدام شريط التمرير في شريط أدوات الشريحة، قم بقياس أقطار الخلايا بعد رسم قطر الخلايا المحددة باستخدام المؤشر. انقر واسحب الماوس لرسم مقاطع تمتد عبر قلب الخلية ، ولاحظ طول المقطع المرسوم في شريط أدوات القياس الموجود على يمين منطقة العرض.
لاكتشاف الخلايا تلقائيا ، ارجع إلى عرض 3D ، وانقر على أيقونة Spot في شريط أدوات الكائن لإضافة كائن Spot جديد في قائمة الكائنات ، وافتح معالج إنشاء البقع التلقائي. في الخطوة الأولى من المعالج، اتخذ خيار تقسيم منطقة اهتمام فقط. ثم قم بتمكين خيار تتبع البقع بمرور الوقت لحساب بيانات التتبع ، بالإضافة إلى إحصائيات الكائن والكائن للسماح بالمقارنة بين المواقع وتوسيع نطاق البيانات.
انقر فوق الزر التالي في أسفل يمين نافذة المعالج. حدد منطقة الاهتمام ، أو منطقة عائد الاستثمار ، التي تحيط بالغطاء البصري للجنين. انقر واسحب الأسهم البيضاء الصغيرة الموجودة على كل وجه منها لتعديل حجم عائد الاستثمار.
ثم قم بتوسيعه ليشمل جميع الإطارات المسجلة مع تعديلات الفاصل الزمني. ثم حدد قناة مصدر، واضبط قياس قطر الخلية الذي تم الحصول عليه مسبقا كقطر XY المقدر. قم بتمكين خيار الطرح في الخلفية ، وانقر فوق التالي.
أدخل قيم عتبة الكثافة مباشرة في مربعات العتبة السفلية والعليا لضمان اكتشاف جميع الخلايا. انقر فوق عرض المنطقة لمراقبة كل هذه التغييرات في الوقت الفعلي. بمجرد الرضا ، انقر فوق التالي للتحقق من صحة عتبة الجودة المحددة ، وانقر فوق منطقة العرض لتصور المواقع التي تلبي هاتين المعلمتين المتراكبتين على القناة المصدر.
بعد ذلك ، حدد الحركة العدوانية الذاتية كخوارزمية تتبع لتتبع الخلايا التي لها حركة مستمرة إلى حد ما. لاحظ حركة البقع بين إطارين للحكم على أطول مسافة تقطعها الخلية بين نقطتين زمنيتين ، وأدخل رقما تقديريا في حقل المسافة القصوى. لتعيين الحد الأقصى لحجم الفجوة ، إذا كان الفاصل الزمني بين الإطارات أقل من 60 ثانية ، فاستخدم حجم ثلاثة ، ولفترات زمنية أطول ، قم بزيادة نفس الحجم.
قم بتمكين فجوات التعبئة مع جميع الكائنات المكتشفة لإسقاط حد الكشف وتوصيل المسارات. ثم انقر فوق التالي ، ودع البرنامج يقوم تلقائيا بإنشاء مسارات لجميع المواقع التي تم إنشاؤها مسبقا. إذا كانت المسارات التي تم الحصول عليها عديدة أو مجزأة ، فارجع إلى معالج الإنشاء باستخدام الزر السابق ، واضبط المسافة القصوى المحددة مسبقا.
لاستبعاد المسارات التي تقل مدتها عن ثلاث إلى ثماني دقائق، أدخل القيمة مباشرة في حقل البيانات للحد الأدنى لمرشح مدة المسار. انقر فوق التالي للتحقق من صحة الفلتر ، وانتقل إلى معالج الإنشاء. قم بإزالة المسارات الناتجة عن بلاعم الجلد يدويا من التحليل للتركيز على الخلايا الدبقية الصغيرة المتنية في الدماغ.
باستخدام محرر المسار ، قم بتصحيح الأخطاء المحتملة الأخرى في المسارات يدويا. على يمين منطقة العرض ، قم بتنشيط زر الدائرة تحديد الوضع ، وقم بتمييز المسارات التي تتطلب تعديلات أو تعديلات. بمجرد تحديد المسار الإشكالي ، باستخدام زري الاتصال وقطع الاتصال ، قم بتحريره لتمثيل حركات الخلايا بشكل صحيح.
باستخدام محرر المسار ، حدد وضع تحديد الدائرة لحذف النقاط الفردية المكررة. إذا كنت تستخدم مراسل الخلايا الدبقية الصغيرة مع خلايا متنية أخرى تحمل علامة الفلورسنت ، فاضبط قطر XY المقدر والمسافة القصوى إلى مجموعة الخلايا الجديدة. قم بتعديل إدخال القناة المصدر إلى الصورة.
أخيرا ، باستخدام علامة التبويب إحصائية ، قم باستخراج إحصائيات التتبع المطلوبة. انقر فوق الزر "إعدادات" ، وحدد الإحصائيات لحساب كل كائن موضعي أو كائن سطحي تم إنشاؤه مسبقا. تم تصوير دماغ الزرد الجنيني بالكامل ، وتم تصور موقع الخلايا العصبية فيما يتعلق بالخلايا الدبقية الصغيرة.
تصور البيانات المكانية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول متوسط سرعة الخلايا الدبقية الصغيرة ، ومتوسط المسافة التي تقطعها في ساعة واحدة ، ومتوسط إزاحتها المربعة ، وتوزيعها في الفضاء في أوقات مختلفة.
