للبدء ، قم بإعداد محلول الطلاء المناسب في المخزن المؤقت ل Tyrode المعدل وقم بتغطية شريحة صغيرة من ثمانية آبار عن طريق احتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل الشريحة الدقيقة المطلية مرتين باستخدام المخزن المؤقت المعدل ل Tyrode. احتضان الشريحة الدقيقة في المخزن المؤقت المعدل ل Tyrode الذي يحتوي على خمسة ملليغرام لكل ملليلتر BSA لمدة 30 دقيقة على الأقل لإخماد الالتصاق غير النوعي.
لتحضير الصفائح الدموية المغسولة ، قامت سترات الطرد المركزي بتخثر الدم الكامل عند 200 غرام لمدة 20 دقيقة للحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية. ثم أضف الإندوميتاسين و PGE1 إلى البلازما الغنية بالصفائح الدموية وأجهزة الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة 10 دقائق. أعد تعليق حبيبات الصفائح الدموية الناتجة في المخزن المؤقت HEPES المعدل ل Tyrode عند 37 درجة مئوية لتحقيق كثافة أربعة في 10 إلى قوة سبعة صفائح دموية لكل ملليلتر.
اترك الصفائح الدموية المعزولة ترتاح لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف محلول DHE إلى معلق الصفائح الدموية لتحقيق تركيز نهائي قدره 10 ميكرومولار واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الحجب من الشريحة الدقيقة وضعه على مرحلة المجهر للتصوير.
ثم الاستغناء بلطف عن الصفائح الدموية. استخدم عدسة غمر الزيت 40X على مجهر متحد البؤر مقلوب لمراقبة تحويل DHE إلى 2-hydroxyethidium. صورة لمدة 10 دقائق ، وجمع الصور كل 10 ثوان.
لمراقبة توليد أنيون الأكسيد الفائق استجابة لناهض ، أضف ناهضا قابلا للذوبان بعد 10 دقائق من توزيع الصفائح الدموية وجمع صور مضان لمدة 10 دقائق إضافية. باستخدام هذا البروتوكول ، تمت دراسة توليد جذور الأكسيد الفائق أثناء التصاق الصفائح الدموية بالكولاجين أو الفيبرينوجين ، ومن الصفائح الدموية الملتصقة ب PLL المحفزة بالثرومبين.
