للبدء ، احصل على البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي للدم الكامل المضاد للتخثر عند 200 جرام لمدة 20 دقيقة. أضف الإندوميتاسين و PGE1 إلى البلازما وأجهزة الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة 10 دقائق. أعد تعليق حبيبات الصفائح الدموية الناتجة في المخزن المؤقت HEPES المعدل ل Tyrode عند 37 درجة مئوية للحصول على كثافة 2x10 ^ 8 صفيحات لكل ملليلتر.
أرح الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف DETC إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار وديفيروكسامين إلى تركيز نهائي قدره 25 ميكرومولار في معلق الصفائح الدموية ، متبوعا ب CMH إلى تركيز نهائي قدره 200 ميكرومولار. ضع العينات في أكواب تجميع مجهزة بمغناطيس تحريك مطلي بالتفلون ، وقم بتحميلها على مقياس التجميع.
بعد دقيقة واحدة ، أضف محفزات مثل الثرومبين أو الكولاجين ، واحتضانها لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، انقل تعليق الصفائح الدموية من كوفيت التجميع إلى أنبوب طرد مركزي صغير وتدور بسرعة عند 6،000 جرام لمدة 10 ثوان. قم بتحميل 50 ميكرولتر من المادة الطافية في ماصات دقيقة شعرية وختمها بشمع مانع للتسرب EPR.
انقل العينات إلى الماسح الضوئي EPR واضبط المعلمات على الماسح الضوئي. تقدير أكسدة CMH إلى CM جذري كمنطقة تحت منحنى قمم EPR المسجلة. احصل على منحنى معايرة باستخدام CM الجذري المتاح تجاريا.
كانت شدة إشارة EPR في العينات متناسبة مع شدة قمم EPR. تم تأكيد خصوصية الكشف باستخدام كاسحات ROS ومثبطات انتقائية للإنزيمات التي تولد أنيون فائق الأكسيد. تشير بيانات تحفيز الصفائح الدموية بالثرومبين أو الكولاجين في وجود مثبط انتقائي VAS2870 إلى أن أوكسيديز NADPH هي المصدر الرئيسي لأنيونات الصفائح الدموية الفائقة استجابة لكل من هذه الناهضات.
