للبدء ، قم بإعداد تعليق وحيد الخلية الطحال للفأر مع واحد في 10 أس ثماني خلايا لكل مليلتر بحجم 0.1 إلى 2 ملليلتر. أضف 50 ميكرولتر من مصل الفئران إلى العينة. انقل العينة إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة خمسة ملليلترات.
أضف 50 ميكرولترا من كوكتيل العزل إلى العينة. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 7.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف الآن 50 ميكرولتر لكل ملليلتر من كوكتيل النضوب.
تخلط جيدا وتحتضن لمدة 2.5 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، دوامة الخرز المغناطيسي لضمان التشتت حتى. أضف 75 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي إلى العينة.
تخلط جيدا وتحتضن لمدة 2.5 دقيقة. قم بتعبئة العينة باستخدام RPMI 1640 متوسط إلى حجم نهائي يبلغ 2.5 ملليلتر واخلطه عدة مرات. ثم ضع الأنبوب في المغناطيس لمدة 2.5 دقيقة.
التقط المغناطيس واقلبه بالأنبوب بحركة واحدة مستمرة ، صب تعليق الخلية المخصب في أنبوب جديد. تحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم. إجراء تحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية الساذجة CD الأربعة الإيجابية قبل وبعد العزل.
بعد البوابات ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد. أجهزة الطرد المركزي في 400G لمدة خمس دقائق وتجاهل طاف. أعد تعليق الحبيبات في 200 إلى 500 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 المكمل ب 10٪ FBS.
لكل ملليلتر واحد من ثقافة الخلايا ، أضف اثنين ميكرولتر من كوكتيل تنشيط الكريات البيض واخلطها. استزرع الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية مع رطوبة مشبعة لمدة أربع إلى ست ساعات.