للبدء ، لوحة 3 في 10 إلى قوة خلايا الساركوما الليفية 6MCA205 في 10 ملليلتر من وسط النمو الكامل في طبق بتري 100 ملم. قم بإشعاع الخلايا بالأشعة فوق البنفسجية واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات على الأقل للسماح لها بالموت. اغسل الخلايا المتغصنة المتمايزة في المختبر ، أو DCs ، مرتين ، عند 1100 جم لمدة أربع دقائق في وسط نمو كامل.
عد DCs الفارغة المشتقة من نخاع العظام باستخدام اختبار استبعاد صبغة Trypan blue. الطرد المركزي للخلايا السرطانية المشععة عند 1100 جرام لمدة خمس دقائق. قم بتعيين الزراعة المشتركة للتيار المستمر الفارغ مع الخلايا المبرمج المشعة بنسبة اثنين إلى واحد في صفيحة مكونة من 12 بئرا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرتين عند 1100 جم لمدة خمس دقائق في 10 ملليلتر من وسط النمو الكامل في أنابيب سعة 15 مل. لتلوين سطح الخلية ، أعد تعليق التيار المستمر المشتق من نخاع العظام في 20 ميكرولترا من عازلة FACS الباردة واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. بعد غسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت FACS ، أضف 100 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على صبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة القابلة للإصلاح لمدة 30 دقيقة.
اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS قبل إعادة تعليقها في المخزن المؤقت FACS. تحديد الخلايا ذات الأهمية بناء على خصائص FSCA و SSCA الخاصة بها. ثم ارسم FSCA و FSCH لاستبعاد مزدوجات الخلايا وتكتلاتها من التحليل.
ارسم نطاق انبعاث 780 إلى 60 نانومتر يمر منطقة المرشح و SSCA لإزالة الخلايا الميتة. باستخدام مرشحات تمرير نطاق انبعاث من 575 إلى 26 و 530 إلى 30 نانومتر ، اكتشف إيجابية الخلية لعلامة CD11C ورابط الخلايا الفلورية PKH67 في مخططين لكثافة المعلمات. بعد العد ، قم بزراعة الخلايا التائية CD8 مع DCs المشتقة من نخاع العظام والتي تناولت خلايا الخلايا المبرمجة MCA205 بنسبة اثنين إلى خمسة إلى واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة.
أضف EdU إلى وسط الزراعة المشتركة بتركيز نهائي 10 ميكرومولار واحتضانه لمدة 16 إلى 20 ساعة. جهاز الطرد المركزي CD8 المتقاطع مرتين عند 1100G لمدة خمس دقائق وصمة عار لعلامات السطح في عازلة FACS الباردة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. بعد غسل الخلايا مرتين في المخزن المؤقت FACS ، أعد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على صبغة مائية قابلة للإصلاح لمدة 30 دقيقة.
اغسل معلقات الخلية مرة واحدة بثلاثة ملليلتر من 1٪ BSA في PBS في أنابيب التدفق. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة لتثبيت الخلايا. احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من النفاذية القائمة على الصابونين وغسل الكاشف لمدة 15 دقيقة.
أضف 500 ميكرولتر من كوكتيل التفاعل واحتضنه لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الغسيل ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من النفاذية القائمة على الصابونين وغسل الكاشف. تحديد الخلايا ذات الأهمية بناء على خصائص FSEA و SSEA.
ثم ارسم FSEA و FSEH لاستبعاد مزدوجات الخلايا وتكتلاتها من التحليل. ارسم نطاق انبعاث 525 إلى 50 نانومتر يمر منطقة المرشح و SSCA لإزالة الخلايا الميتة. باستخدام مخططات كثافة مرشح نطاق انبعاث 530 إلى 30 و 575 إلى 26 نانومتر ، اكتشف إيجابية الخلايا ل CD8a و CD3.
قم بتحليل الخلايا لدمج Alexa Fluor 647 EdU في رسم بياني لمعلمة واحدة باستخدام مرشح انبعاث تمرير نطاق 660 إلى 620 نانومتر. ابتلعت الخلايا المتغصنة الإيجابية CD11c بشكل فعال الخلايا السرطانية MCA205 المبرمج عند 37 درجة مئوية ، مما يدل على البلعمة المعتمدة على درجة الحرارة في مراحل دورة مناعة السرطان المبكرة. بعد البلعمة ، أظهرت الخلايا المتغصنة مستويات متزايدة من CD86 و MHC-II جنبا إلى جنب مع انخفاض مستويات PDL1.
كان التوسع النسيلي للخلايا التائية الإيجابية CD8 التي تم تنشيطها بواسطة الخلايا المتغصنة الناضجة واضحا بمعدل انتشار 20٪ تقريبا. باستخدام نماذج الورم على الرقاقة ، لوحظت الاستجابة الكيميائية لهذه الخلايا التائية تجاه الخلايا السرطانية المنبثقة عن الذارين.
