بعد استعادة CD8 المسبق من الزراعة المشتركة ، قم بطردها بوزن 1100 جم لمدة 10 دقائق في 10 مل من وسط النمو الكامل. أعد تعليق 1 × 10 إلى قوة 7 خلايا إجمالية في 100 ميكرولتر من ميكروبيدات إزالة الخلايا الميتة ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع أعمدة الفصل في الفاصل المغناطيسي ، واشطفها بمحلول ربط.
انقل تعليق الخلية إلى أعمدة الفصل ، واجمع التدفق. بعد غسل العمود ، اجمع الخلايا غير المسماة التي تمر ، ودمجها مع التدفق الذي تم جمعه مسبقا. جهاز طرد مركزي مخصب CD8 الحي المتقاطع عند 1100 جم لمدة خمس دقائق في وسط نمو كامل.
بعد العد ، قم بزراعة الخلايا المصابة CD8 بخلايا MCA205 جديدة بنسبة اثنين إلى واحد في 12 لوحة بئر ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. قبل التعافي من مستجيب CD8 ، أضف مونينسين وبريفيلدين إلى الزراعة المشتركة للخلايا المناعية السرطانية لمدة ست ساعات. ثم استرجع مستجيب CD8 ، وجهاز الطرد المركزي مرتين عند 1100 جم لمدة خمس دقائق.
أعد تعليق الخلايا في ثلاثة خلطات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية المحضرة في محلول FACS البارد ، واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، للحماية من الضوء. أضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى حنك الخلية من Mix C واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت للغسيل البارد ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
بعد غسل الخلايا مرتين في المخزن المؤقت FACS ، أضف 100 ميكرولتر من PBS الذي يحتوي على Vitality Fixable Aqua Dye إلى كريات الخلايا لمدة 30 دقيقة. تحديد الخلايا ذات الأهمية بناء على خصائص FSCA و SSCA الخاصة بها. ثم ارسم FSCA و FSCH لاستبعاد مزدوجات الخلايا وتكتلاتها من التحليل.
ارسم مرشح تمرير نطاق انبعاث 525/50 نانومتر و SSCA لإزالة الخلايا الميتة ، باستخدام مرشحات تمرير نطاق انبعاث 660/20 و 780/60 نانومتر ، اكتشف إيجابية الخلية ل CDAA و CD3 في مخططين لكثافة المعلمات. علاوة على ذلك ، قم بتحليل الخلايا بحثا عن علامات CD44 و CD25 و CD69 لعلامة CD137 ، والإنترفيرون جاما الإيجابي والجرانزيم B للمزيج A و B و C ، على التوالي. لاختبار قتل الورم ، استكمل وسط الزراعة المشتركة بصبغة قياس موت الخلايا في الوقت الفعلي.
بعد تسخين اللوحة إلى 37 درجة مئوية في نظام تحليل الخلايا الحية ، قم بإجراء مسح البيانات كل ساعتين لمدة تصل إلى 72 ساعة. الطرد المركزي للخلايا مرتين عند 1000 غرام لمدة خمس دقائق. قم بتلطيخ الخلايا لعلامات السطح بسعة 20 ميكرولتر من محلول FACS البارد واحتضانه لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام.
ثم أضف صبغة حيوية بروبيديوم يوديد لتلطيخ الخلايا لاستراتيجية البوابات. تحديد الخلايا ذات الأهمية بناء على خصائص FSCA و SSCA الخاصة بها. ثم ارسم FSCA و FSCH لاستبعاد مزدوجات الخلايا وتكتلاتها من التحليل.
استخدم مرشح تمرير نطاق انبعاث 450/50 نانومتر للكشف عن الخلايا السرطانية السلبية ل CD45. في الرسم البياني لمعلمة واحدة ، باستخدام مرشح انبعاث تمرير النطاق 610/620 نانومتر ، قم بتحليل الخلايا لدمج يوديد البروبيديوم كمتوسط شدة الفلورسنت. من خلال قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات ، تم تحسين مستويات التعبير السطحي لعلامة التنشيط المبكر CD69 ، وعلامات التنشيط المتأخر CD44 و CD25 ، والتعبير الغشائي ل CD137 ، و CD107 ، وعلامات تفاعل الورم.
زادت المستويات داخل الخلايا للجزيئات السامة للخلايا ، الجرانزيم B ، والإنترفيرون جاما الإيجابي بشكل تدريجي وملحوظ ، لتصل إلى ذروة التعبير في 72 ساعة من الزراعة المشتركة. خضعت خلايا MCA205 المتشابكة المتشابهة لمستويات كبيرة من الموت بوساطة مستجيب CD8.
