للبدء ، اغسل عينة الأذين البشري الطازج في لوحة زجاجية 100 ملم تحتوي على HBSS معقمة. رج العينات برفق في اللوحة لإزالة أي دم متبقي. نقل العينة إلى لوحة 100 ملم مبللة مع كمية صغيرة من HBSS.
باستخدام المشارط المتقاطعة ، اقطع العينة إلى مكعبات بحجم 2 ملليمتر. بعد ذلك ، انقل أربع شظايا صغيرة من عضلة القلب إلى لوحة 35 ملم. ضع غطاء زجاجيا معقما فوق الشظايا واضغط برفق.
ماصة 1.5 ملليلتر من DMEM في اللوحة. ثم احتضان لوحات الاستزراع عند 37 درجة مئوية ، تحت مكملات ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. عندما تصل الثقافات إلى التقاء 85٪ ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة واستخدم ملقط معقم لرفع زجاج الغطاء.
ثم ضعه رأسا على عقب على لوحة جديدة 35 ملم. ثم أضف برنامج تلفزيوني معقم لشطفه. الآن إزالة شظايا عضلة القلب.
ثم ماصة DMEM من اللوحة. استخدم برنامج تلفزيوني معقم لشطف اللوحة التي تحتوي على الخلايا المتخلفة. بعد التخلص من الشطف ، أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ trypsin EDTA إلى كل طبق ، واحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة خمس دقائق.
بعد الحضانة ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة واستخدم المجهر لتأكيد انفصال الخلية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من محلول توقف التربسين ، أو TSS ، في كل لوحة لمنع التربسين. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم 15 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي في 400 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. نضح الطافع باستخدام ماصة مصلية خمسة ملليلتر. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من DMEM إلى الحبيبات وأعد تعليقها.
ضع تعليق الخلية على لوحة 60 ملم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، تحت مكملات ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد ذلك ، ماصة ثلاثة ملليلتر من محلول الجيلاتين المعقم 0.2 ٪ لكل لوحة 60 ملم.
بعد الحضانة ، استنشق المحلول وأضف ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم حتى الاستخدام مرة أخرى. أخرج اللوحة التي تحتوي على الخلايا الليفية القلبية من الحاضنة. قم بإزالة DMEM من اللوحة واشطفها باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.
بعد التخلص من الشطف، أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ تربسين EDTA إلى كل طبق. استخدم المجهر لتأكيد انفصال الخلية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من TSS في كل لوحة لمنع التربسين.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 400 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. نضح الطافع باستخدام ماصة مصلية خمسة ملليلتر.
ثم أضف ثلاثة ملليلتر من DMEM إلى الحبيبات وأعد تعليقها. قم بإزالة PBS من اللوحة المطلية بالجيلاتين مقاس 60 ملم وضع تعليق الخلية في اللوحة. استزرع الخلايا الليفية في حالة التقاء لمدة تصل إلى 21 يوما.
بعد 21 يوما من الثقافة ، استنشق وسط الثقافة. ثم شطف لوحات مع ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد استنشاق PBS وإضافة ملليلتر واحد من محلول إزالة الخلايا ، راقب اللوحة تحت مجهر تباين مقلوب.
بعد دقيقتين ، ماصة بلطف أربعة ملليلتر من PBS لتخفيف محلول إزالة الخلايا في الألواح. نضح الحل المخفف. ثم شطف بلطف لوحات مع برنامج تلفزيوني.
أخيرا ، أضف ملليلتر واحد من PBS إلى اللوحات. قم بتخزين الألواح المطلية بالمصفوفة خارج الخلية عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. لوحظ نمو الخلايا الليفية من شظايا صغيرة من عضلة القلب الأصلية الموضوعة في الثقافة في غضون ثلاثة إلى خمسة أيام.
أدى نزع الخلايا إلى طلاء مصفوفة خارج الخلية على سطح اللوحة. تم الحفاظ على تكوين وبنية مصفوفة القلب خارج الخلية المنتجة في المختبر بسبب إزالة الخلايا.
