للبدء ، ضع تروفوزويتات Naegleria gruberi المجمدة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. استزرع التروفوزويتات في وسط PYNFH عند 25 درجة مئوية حتى حوالي 80٪ متقاربة. ضع القارورة المتقاربة على الثلج لمدة خمس إلى 10 دقائق لتحرير التروفوزويتات الملتصقة من البلاستيك.
ثم قم بتدوير القارورة برفق لإزاحة أي خلايا ملتصقة متبقية. استبدل الوسائط بوسائط تكيسية معقمة لتعريف خلايا Naegleria gruberi. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الخراجات من القارورة.
أجهزة الطرد المركزي الخراجات في 600 × غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخراجات في ملليلتر من وسائط PYNFH مع مصل العجل الجنيني بنسبة 10٪ لإخراج الخلايا. احتضان الخراجات عند 25 درجة مئوية لمدة 72 ساعة حتى تظهر trophozoites وتصل إلى التقاء 80٪.
لنقل التروفوزويتات ، قم أولا بلوحة ملليلتر واحد من التروفوزويتات إلى صفيحة استزراع أنسجة مسطحة القاع مكونة من ستة آبار وقاعية. بعد ذلك ، احتضان خليط كاشف نقل البلازميد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ماصة ما يقرب من 800 ميكرولتر من الوسط من طبقات التروفوزويتات الأحادية قبل النقل مباشرة.
ثم أضف 200 ميكرولتر من خليط كاشف نقل البلازميد إلى trophozoites. قم بتدوير اللوحة برفق كل 15 دقيقة لمنع الوسائط من التجمع عند حواف اللوحة والجفاف. بعد ساعة ، أضف 10 وحدات من DNase في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت 10X DNase وأضفه إلى الآبار.
احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة الحمض النووي البلازميد المتبقي. الآن اغسل اللوحة مرة واحدة بمليلتر واحد من وسط النمو ، ثم أضف ملليلتر من الوسائط الطازجة. احتضان اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 إلى 36 ساعة.
عند اكتمال الحضانة ، قسم محتويات البئر إلى صفيحة جديدة بنسبة 1: 2. ثم جمع trophozoites من الآبار المتبقية لمزيد من التحليل. كانت Naegleria gruberi trophozoites أميبية وملتصقة بقوارير الاستزراع في ظل ظروف الاستزراع القياسية.
أدت حضانتها على الجليد إلى تروفوزويت مستديرة وغير ملتصقة. تسبب احتضان trophozoites في وسط التكيسية لهم لتصبح encysted.
