للبدء ، أضف 200 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 100 مليمولار إلى أنبوب يحتوي على تروفوزويتات منقولة من النيجلرية الجروبيري. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 600 جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 100 مليمول EDTA.
ضع الأنبوب في كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند 98 درجة مئوية لتحلل الخلايا. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق بأقصى سرعة لتكسير الحطام. نقل طاف في أنبوب جديد.
بعد ذلك ، أضف 0.5 حجم من أسيتات الأمونيوم ، وثلاثة مجلدات من الإيثانول المطلق ، وميكرولتر واحد من الجليكوجين إلى المادة الطافية. اقلب الأنبوب عدة مرات للخلط ، قبل احتضانه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل. بعد الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في 16،000G.
قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ، وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ لغسلها قبل الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات المجففة في ماء منزوع الأيونات معقم لتحقيق كثافة تروفوزويت تبلغ 10،000 تروفوزويتات لكل ميكرولتر. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل مع التمهيدي الخاص بالحمض النووي المنقول والكشف عن التروفوزويت المحول ، أضف ميكرولتر من صبغة التحميل 6X إلى عينات CERE.
ثم قم بتحميل العينات المصبوغة على جل أغاروز 0.8٪. بعد الفلورة الكهربائية للهلام لمدة 1.5 إلى 2 ساعة ، احتضانه في صبغة الحمض النووي المخففة في 100 مل من الماء منزوع الأيونات. انقل الجل الملون إلى ماء منزوع الأيونات لمدة 20 دقيقة لإزالة البقع منه.
تصور الجل على نظام الأشعة فوق البنفسجية لتوثيق النتائج. أظهر تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل أنه تم اكتشاف pGRUB في التروفوزويتات المنقولة من خلال سبعة ممرات على الأقل. فقد pGEM بعد المقطع الأول ، مما يشير إلى أن البلازميد الفارغ لم يتم الاحتفاظ به بواسطة الأميبا.
