للبدء ، ضع الفأر المخدر على جهاز تجسيم. قم بعمل شق مستمر على طول خط الوسط لفروة الرأس باستخدام مقص جراحي وقطع جزء من فروة الرأس لكشف سطح الجمجمة. قم بعمل حج القحف في المنطقة المحددة باستخدام المثقاب الصغير وقم بتعيين أربع نقاط كحدود.
توقف عن الحفر عندما تصبح أنسجة المخ مرئية. استخدم لوحة التحكم لضبط الحاقن على حقن 80 نانولترا من الفيروس. انقر فوق الزر "حقن" في لوحة التحكم لحقن الفيروس في التلفيف المسنن بمعدل تدفق 1 نانولتر في الثانية.
لشفط أنسجة المخ ، قم بتدوير طرف الإبرة الحادة عن كثب فوق أنسجة المخ ، واضغط برفق لتسهيل الشفط. اشطفه باستمرار بالمحلول الملحي البارد أثناء الشفط للحفاظ على رؤية واضحة للدماغ. راقب ملامح الأنسجة عن كثب لمراقبة عمق الشفط.
الأنسجة القشرية وردية شاحبة. يظهر الجسم الثفني تحته على شكل نسيج ليفي أبيض. وطبقة الحصين CA1 حمراء داكنة ورمادية.
أوقف الشفط عندما يصبح سطح الأنسجة أملسا وتتعرض مساحة كبيرة من CA1. حرك الحامل المتصل بعدسة الابتسامة فوق الفتحة المحفورة. عندما تلامس عدسة الابتسامة سطح أنسجة المخ ، اضبط المحور Z على الصفر.
أدخل عدسة الابتسامة في الفتحة الموجودة في المحور البطني الظهري ناقص 1.32 ملم. اترك الحامل يقف لمدة 5 إلى 10 دقائق. ثم ارفع الحامل واشطف الفتحة بالمحلول الملحي.
باستخدام إبرة ، ضع راتنج الأشعة فوق البنفسجية حول عدسة الابتسامة. قم بإضاءة المنطقة بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية للتأكد من أن الراتنج يصبح صلبا. قم بإزالة الحامل بعناية من عدسة الابتسامة.
قم بتغطية الجمجمة المكشوفة بالكامل براتنج الأشعة فوق البنفسجية. ضع صفيحة الرأس على الجمجمة في الموضع المناسب. قم بإضاءة الجمجمة ولوحة الرأس بالكامل بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية.
قم بتغطية عدسة الابتسامة المكشوفة بغطاء واقي مطبوع ثلاثي الأبعاد. ثبت الغطاء على لوحة الرأس باستخدام مسامير M1.6. قم بتشغيل برنامج التحكم Miniscope وانقر فوق تحديد ملف التكوين.
ثم حدد vscode، متبوعا بملفات تكوين المستخدم. الآن ، انقر فوق تشغيل. ثم حرك زر الطاقة LED لضبط السطوع.
حرك زر ضبط التركيز لتعيين القيمة بالقرب من الصفر. قم بتوصيل لوحة القاعدة بالمنظار المصغر وأعد ضبط موضع المنظار المصغر للحصول على مجال رؤية بجودة تصوير جيدة. قم بتطبيق الطبقة الأولى من مادة قاعدة أطقم الأسنان بعناية حول لوحة قاعدة المنظار المصغرة.
بمجرد أن تصلب الطبقة الأولى من الأسمنت ، ضع طبقة ثانية من الأسمنت من لوحة القاعدة على لوحة الرأس. بعد أن تصلب كل مادة قاعدة طقم الأسنان ، قم بفك برغي التثبيت وافصل المنظار المصغر عن لوحة القاعدة. ضع غطاء لوحة القاعدة في لوحة القاعدة لحماية عدسة الابتسامة المكشوفة وشد برغي الضبط.
بعد التصوير ، قم بتحويل بيانات التصوير من تنسيق AVI إلى تنسيق HDF5. قم بتطبيق تصحيح الحركة غير الصلبة وقم بتقليل الفيلم المصحح بالحركة. قم بتطبيق الاستخراج على بيانات العينة السفلية لتحديد إشارات الخلية الواحدة.
ثم قم بتطبيق فحص الخلية وحدد الخلايا المحتملة يدويا. انقر فوق حفظ البيانات قبل إغلاق نافذة فحص الخلية. أخيرا ، احفظ ملفات البيانات.
في تصوير الكالسيوم غير الناجح في الجسم الحي ، لم يلاحظ أي خلايا نشطة في مجال رؤية التصوير. أظهر تصوير الكالسيوم الناجح في الجسم الحي أقل من 10 خلايا نشطة بدون أوعية دموية واضحة. أكثر من 50 خلية نشطة ذات أوعية دموية مرئية.
ومئات الخلايا النشطة ذات الأوعية الدموية الصافية. تم تركيب الخلايا الفردية المستخرجة من تسجيل تصوير الكالسيوم الناجح في الجسم الحي على مجال الرؤية مع آثار الكالسيوم التمثيلية المعروضة. تم التحقق من موضع تعبير GCaMP6F ومسار عدسة الابتسامة في شريحة دماغ الفأر.
