للبدء ، احصل على لوحة استزراع مع مستعمرات أنواع Methylomonas LW13. تلقيح المستعمرات في ستة ملليلتر من أملاح النترات المعدنية المتوسطة في أنبوب زجاجي. أغلق الأنبوب بسدادة مصل وختم تجعيد من الألومنيوم.
أضف الميثان باستخدام حقنة لخلق جو نهائي بحجم 50٪ من حجم الميثان في الهواء. هز هذه الثقافة السائلة العوالق في 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى تعكر ، الأمر الذي يستغرق حوالي يوم واحد. قم بتمرير الثقافات السائلة بنسبة واحد إلى 10 إلى وسائط جديدة.
الاستمرار في تنمية المزارع السائلة من الميثانوتروف لتسجيل نمو المرحلة ، لتصل إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من حوالي 0.5. لتحضير المحقنة ، قم بإزالة الغطاسات المصاحبة ووضعها في وعاء معقم. قم بتوصيل طرف مرشح بولي تترافلورو إيثيلين أو PTFE معقم بكل حقنة وضع المحقنة في رف أنبوب اختبار قياسي مع توجيه الطرف لأسفل.
ثم ، قم بخلط ملليلتر واحد من الخلايا مع خمسة ملليلتر من أملاح النترات المعدنية المتوسطة وأربعة ملليلتر من الأغاروز المنصهر في أنبوب مخروطي معقم. صب ببطء خليط الأغاروز في المحقنة حتى علامة ثمانية ملليلتر واتركه يصلب. بعد حوالي 15 دقيقة ، قم بتغطية المحقنة بسدادة بوتيل مطاطية معقمة مقاس 20 ملم.
ثبت السدادات بشريط المختبر وقم بتسمية المحقنة. بعد ذلك ، املأ حقنة كبيرة سعة 60 ملليلتر بميثان 100٪ وأرفق طرف مرشح PTFE متصلا بإبرة معقمة قياس 23. اخترق سدادة المطاط للمحقنة بمزيج الأغاروز مع حقنة كبيرة ، وأدخل إبرة معقمة ثانية كمخرج للغاز.
اضغط على مكبس المحقنة الكبيرة للسماح ل 20 ملليلتر من الميثان بنسبة 100٪ بالتدفق عبر مساحة الرأس. قم بإزالة إبرة المخرج عندما يتبقى واحد إلى ملليلتر من الميثان في المحقنة لمنع التدفق العكسي للأكسجين. احتضان المحقنة بمزيج الأغاروز والميثان عند 18 درجة مئوية.
لبثق الأغاروز ، استبدل طرف مرشح PTFE بإبرة معقمة قياس 23 وسدادة مطاطية بمكبس المحقنة المرفق. قم بالضغط ببطء على المكبس لتوزيع زيادات ملليلتر واحدة في أنابيب طرد مركزي معقمة منفصلة سعة 1.5 ملليلتر. شكلت سلالة LW13 من النوع البري شريطا أفقيا متميزا على عمق معين في حقنة التدرج حيث كانت تركيزات الميثان والأكسجين منخفضة.
أظهر LW13 الملقح في محاقن متدرجة تدرجا لتدرج مضاد للميثان والأكسجين مع استنفاد الميثان واستهلاك الأكسجين المقابل لعمق النطاق الأفقي. يفتقر طافر حذف الشوفان في LW13 إلى تكوين الشريط الأفقي المميز الذي لوحظ في سلالة النوع البري ، مما يشير إلى دور الجين في هذا النمط الظاهري.
