تسلسل سانجر المعزز بتضخيم إزاحة المانع للكشف عن الطفرات منخفضة التردد في الأنسجة السرطانية

للبدء ، قم بإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل ، أو PCR ، لتضخيم المنطقة المرغوبة من الحمض النووي المستخرج من الأنسجة. أحضر المزيج الرئيسي لإنزيم تضخيم التسلسل ، والمخزن المؤقت ، والماء المقطر المزدوج إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتدويره على الفور. بعد تحضير الأنابيب للتسلسل ، ضع أنبوب PCR على أداة PCR المحددة مسبقا للتضخيم.

ثم قم بإزالة المنتج من أداة PCR وتخزين منتجات التفاعل في الثلاجة ، محمية من الضوء. دوامة الخرز المغناطيسي بدقة. أضف 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي و 40 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى لوحة 96 بئرا وأغلق اللوحة بفيلم.

ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا على شاكر دوامة لمدة 10 ثوان لتعليق الخرز وخلطه بالكامل. ثم قم بتأمين اللوحة بشريط مطاطي على مذبذب أفقي واهتز عند الإعداد الأقصى لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع لوحة PCR على حامل مغناطيسي ، مع التأكد من الضغط عليها بإحكام.

حافظ على الحامل عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق للامتزاز الثابت. بمجرد امتصاص الخرز ، قم بإزالة فيلم السقف واسكب سائل النفايات. شطف الخرز مرتين مع 40 ميكرولتر من 80 ٪ من الإيثانول.

بعد سكب سائل النفايات ، ضع اللوحة على ورق ماص واتركها حتى تجف برفق. ضع الورق الماص مع اللوحة المغناطيسية في جهاز طرد مركزي وقم بتدويره عند 120 جم لفترة وجيزة. بعد إزالة الكحول ، ضع الطبق في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لتجفيف الخرز تماما.

بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من الماء النقي إلى اللوحة وختمها بفيلم. رجها على شاكر دوامة لمدة ثلاث إلى خمس ثوان وضع اللوحة على شاكر أفقي. قم بتثبيته واترك اللوحة تهتز لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لإذابة منتج التسلسل المنقى.

أخيرا ، قم بتدوير منتج التسلسل المذاب عند 180 جم واستخدم المنتج للتحليل الجينومي باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري. يمكن لهذه الطريقة اكتشاف طفرة RHOA G17V المعروفة وغيرها من الطفرات منخفضة التردد في فترة التضخيم لبادئات المنبع والمصب. كما تم تحليل الطفرات في جينين إضافيين ، وهما IDH2 و JAK1 ، بشكل صحيح باستخدام هذه الطريقة.