تحليل الصفيحة الدقيقة القائمة على الامتصاص لاختبار استقرار مصل الأدينوزين البشري ديميناز 1

للبدء ، قم بإعداد مخاليط المصل والإنزيم جنبا إلى جنب مع الضوابط الخاصة بها. في قارئ الصفيحة الدقيقة ، قم بإعداد بروتوكول قراءة حركية لقياس الامتصاص عند 260 نانومتر مع أقصر فاصل قراءة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإذابة جميع العينات المجمدة على الجليد وتخفيف كل عينة مذابة من 1 إلى 10 باستخدام 1x PBS تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة LoBind.

لتحضير مخزون الأدينوزين بمقدار خمسة ملليمولار، أضف 66.8 ملليغرام من الأدينوزين إلى 50 ملليلترا من 1x PBS. بعد تخفيفه إلى محلول 250 ميكرومولار ، قم بتسخين الأدينوزين مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. إلى صفيحة ميكروية متوافقة مع الأشعة فوق البنفسجية 96 بئرا ، أضف 160 ميكرولترا من الأدينوزين متبوعا ب 40 ميكرولترا من كل عينة بروتين مخففة في ثلاث نسخ.

قم بقياس امتصاص كل بئر عند 260 نانومتر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لتحليل البيانات ، قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات ، ثم حدد ميل المنطقة الخطية لبيانات الامتصاص كدالة للوقت في الدقائق العديدة الأولى. اطرح منحدر التحكم السلبي الذي يتكون من مصل بشري مجمع أو PBS من منحدرات الإنزيم بالإضافة إلى مخاليط المصل ومخاليط الإنزيم بالإضافة إلى PBS على التوالي.

أخيرا ، قم بتطبيع جميع المنحدرات المعدلة إلى المنحدر الأصلي عند نقطة زمنية ساعة الصفر للحصول على جزء النشاط المتبقي باستخدام المعادلة ، وارسم جزء النشاط المتبقي مقابل الوقت. انخفض نشاط Wildtype HsADA1 بسرعة أكبر في المصل البشري المجمع مقارنة ب 1x PBS على مدار خمسة أيام. أظهرت منحنيات انخفاض الامتصاص للنوع البري HsADA1 منحدرا أوليا أكثر حدة في اليوم صفر مقارنة باليوم الخامس.

أظهرت عينات التحكم السلبية تغيرا ضئيلا في الامتصاص مقارنة بعينات الإنزيم.