تطوير طبقة أحادية الظهارة المبيضية البشرية والعضيات لدراسة التجديد وتأثيرات الأدوية

للبدء ، قم بإذابة الخلايا الظهارية المحفوظة بالتبريد. امزج الخلايا مع 10 مل من وسط الغسيل. بعد الطرد المركزي للخلايا ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من ظهارة سطح المبيض أو وسط OSE 2D وانقلها إلى بئرين من صفيحة 12 بئرا.

أضف ملليلترا واحدا من وسط OSE 2D الإضافي في البئر وزراعته عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة قبل تجديد الوسائط الأولى. استخدم تلطيخ Trypan Blue لحساب الخلايا الظهارية الحية المذابة حديثا أو المذابة بالتبريد على سطح المبيض البشري باستخدام عداد خلايا آلي. امزج العدد المطلوب من الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الأساسي العضوي المثلج البارد ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 240 جم لمدة خمس دقائق.

باستخدام ماصة ، أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول استخراج الغشاء القاعدي غير المخفف المثلج للحصول على 10 ، 000 خلية لكل 10 ميكرولتر. أضف 10 قطرات ميكرولتر من محلول مستخلص الغشاء القاعدي OSE لكل بئر في شريحة متعددة الآبار دافئة مسبقا وضع اللوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. بعد أن يتجمد الجل ، أضف 100 ميكرولتر من وسط OSE 3D وزراعته عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد إزالة الوسط المستهلك ، أضف 100 ميكرولتر من DMEM F12 المتقدم المثلج البارد إلى كل بئر. اكشط قاع الآبار بطرف ماصة P1000 لفصل قطرات الجل ونقل كل قطرة هلام عائمة إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 240 جم لمدة خمس دقائق.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفكك الخلايا وضع الأنابيب في حمام حبة دافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من الوسط الأساسي العضوي OSE البشري ، وجهاز الطرد المركزي عند 240 جم لمدة خمس دقائق. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات بالحجم المطلوب لمحلول استخراج الغشاء القاعدي غير المخفف لإعادة زرعها بنسبة مناسبة للزراعة.

أظهرت خلايا OSE البشرية الأولية مورفولوجيا تشبه الحصى حتى المقطع الثالث ، لكنها أظهرت علامات الشيخوخة بعد ذلك. نمت عضيات OSE البشرية من خلايا OSE المعزولة حديثا بشكل أكبر من تلك الموجودة في خلايا OSE الموسعة ثنائية الأبعاد بعد 14 يوما في الثقافة. لوحظت أشكال مختلفة في عضيات OSE ثلاثية الأبعاد ، بما في ذلك مجموعات الخلايا الكيسية ، أحادية الطبقة ، متعددة الطبقات ، وغير اللومينيزية.