للبدء ، قم بترتيب المخزن المؤقت للحجب المعقم للمرشح المحضر حديثا ، ومخزن تفاعل 10X واحد واثنين على منصة عمل. ضع الأنابيب المفتوحة التي تحتوي على 2.5 مل من المخزن المؤقت المانع وخمسة ملليلتر من الماء عالي النقاء في مجفف وتفريغ الغازات تحت الفراغ. بعد 15 دقيقة ، حرر الضغط وقم بإزالة الأنابيب.
ضع مجموعة خلايا تدفق البيوتين PEG المحضرة على مرحلة المجهر وقم بتثبيتها باستخدام معجون لاصق في كل طرف. قم بتوصيل أنبوب مخرج خلية التدفق بمضخة الحقنة عبر الإبرة. قم بتشغيل السخان الموضوعي إلى 30 درجة مئوية.
قم بتأمين واحد إلى ملليلترين من الماء منزوع الغاز في أنبوب إلى قطعة منفصلة من المعجون اللاصق بالقرب من خلية التدفق. أدخل أنبوب المدخل في الأنبوب حتى يصل إلى القاع وتدفق المياه عبر القناة. قم بزيادة معدل التدفق لإزالة أي فقاعات محاصرة بالقرب من أنبوب المدخل.
أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع المنزوع الغازات إلى 20 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل مليلتر من الستربتافيدين. قم بتوصيل الأنبوب المفتوح بالمعجون اللاصق. انقل أنبوب المدخل من الماء إلى الستربتافيدين وابدأ التدفق بمعدل 40 ميكرولتر في الدقيقة لمدة دقيقتين.
بعد خمس دقائق ، اغسل الستربتافيدين الزائد باستخدام المخزن المؤقت المانع. التدفق في الحمض النووي الحيوي المخفف في المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 25 نانومولار SYTOX Orange. صورة باستخدام المنظر المباشر باستخدام الليزر 532 نانومتر لمشاهدة ربط الحمض النووي بالسطح في الوقت الفعلي.
بمجرد تحقيق الكثافة المطلوبة للحمض النووي على السطح ، قم بالتدفق في مخزن مؤقت مانع يحتوي على 25 نانومولار SYTOX لغسل الحمض النووي الحر. الآن ، يتم تخفيف التدفق والأجسام المضادة للديجوكسجينين المضادة للبيوتينيل في مانع المخزن المؤقت الذي يحتوي على 25 نانومولار SYTOX Orange. اغسل الجسم المضاد المضاد للديجوكسيجينين المضاد للبيوتينيل و SYTOX Orange مع المخزن المؤقت المانع.
تدفق 50 ميكرولترا من مزيج ATP-gamma-S في خلية التدفق. أضف هيليكاز CMG المنقى إلى ما يقرب من 100 تركيز نهائي نانومولار في 30 ميكرولتر من مزيج ATP-gamma-S وتدفقه بمعدل 20 ميكرولتر في الدقيقة ل 20 ميكرولترا. احتضن لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بالتدفق في مزيج ATP RPA بمعدل 40 ميكرولتر في الدقيقة لكل 80 ميكرولترا. باستخدام كل ليزر مع تعرض من 50 إلى 100 مللي ثانية ، قم بتصور والحصول على EGFP RPA باستخدام ليزر 488 نانومتر ، ثم احصل على CMG بليزر 640 نانومتر. أخيرا ، تصور والحصول على الحمض النووي الملون باللون البرتقالي SYTOX باستخدام ليزر 532 نانومتر.
تم تصور فك هيليكاز CMG للحمض النووي من خلال النمو الخطي ل RPA الأصفر الذي تم تتبعه بمرور الوقت ، مما يشير إلى خيوط الحمض النووي غير الملفوفة. قلل تلف الحمض النووي أحادي الشريطة من عدد أحداث الفك الناجحة التي لوحظت كما يتضح من عدد أقل من الآثار الكاملة في البيانات.
