للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت الرئيسي. قم بتصفيته باستخدام مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر ، وقم بتخزين المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد 75 مل من المخزن المؤقت للاستخراج عن طريق استكمال المخزن المؤقت الرئيسي بثلاثة أقراص مثبطة للبروتياز خالية من EDTA ، و 2 مللي مولار ATP ، و 0.1 مللي مولار DTT.
ثم أضف 75 مل من المخزن المؤقت للاستخراج إلى حبيبات الخلية البكتيرية المجمدة التي تعبر عن الميوسين السابع, واترك الحبيبات في مخزن الاستخراج على الجليد حتى تذوب. بعد ذلك ، استخدم ماصة مصلية لتفتيت الحبيبات لتسريع عملية الذوبان. الآن صوتنة إعادة التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق بسعة 50٪ باستخدام طرف نصف بوصة مع 5 ثوان تشغيل و 5 ثوان.
جهاز الطرد المركزي إجمالي المحللة عند 33،746 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أثناء الطرد المركزي ، اغسل 3 مل من الملاط بنسبة 50٪ من راتنج التقارب المضاد ل FLAG مع 40 مل من PBS لتحضير 1.5 مل من راتنج FLAG. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للراتنج عند 800 جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
قم بإزالة PBS بعناية دون إزعاج الراتنج. ثم أضف المادة الطافية من الطرد المركزي المحلل إلى الراتنج المغسول واحتضانها بدوران مستمر عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. حبيبات الراتنج عن طريق الطرد المركزي عند 800 جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
وإزالة المادة الطافية دون إزعاج الراتنج. بعد ذلك ، أعد تعليق الراتنج في 40 مل من المخزن المؤقت الرئيسي وأجهزة الطرد المركزي عند 800 جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الراتنج.
الآن انقل الراتنج المغسول إلى عمودين من البولي بروبلين. اغسل كل عمود مرة واحدة باستخدام 2 مل من المخزن المؤقت الرئيسي. ثم قم بالطرد المركزي للعمود عند 1 ، 400 جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية لإزالة المخزن المؤقت الرئيسي.
لتحضير مخزن مؤقت للشطف ، أضف 100 ميكروغرام لكل مليلتر من ببتيد FLAG إلى المخزن المؤقت الرئيسي. أضف 300 ميكرولتر من محلول الشطف إلى الراتنج المعبأ في كل عمود. امزج برفق عن طريق سحب العينات لضمان ترطيب الراتنج تماما بواسطة عازلة الشطف.
ثم قم بالطرد المركزي للأعمدة عند 1 ، 400 جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. انقل التدفق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف واحتفظ به على الجليد. الآن ، قم بإجراء SDS-PAGE مع كسور الشطف لتحديد تركيزاتها النسبية.
أثناء تشغيل الجل ، قم بإعداد مخزن مؤقت لغسيل الكلى بالتركيبة المحددة. ثم اجمع بين الكسور الأكثر تركيزا. انقل العينة إلى كاسيت غسيل الكلى بوزن جزيئي 10,000 وقم بغسيل الكلى طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
في اليوم التالي ، قم بتفريغ العينة بعناية من كاسيت غسيل الكلى. Aliquot 15 ميكرولتر لكل أنبوب PCR وإسقاط الأنابيب في وعاء من النيتروجين السائل للتجميد السريع. تم تأكيد مركب الميوسين VIIA المنقى بواسطة SDS-PAGE ، حيث أظهر شريطا أعلى علامة دالتون 200 كيلو ، يتوافق مع سلسلة الميوسين VIIA الثقيلة ، وثلاثة نطاقات مميزة بين علامات دالتون 22 و 14 كيلوغراما تمثل RLC calmodulin والبروتين الشبيه بالكالمودولين 4.
