علاج مزارع النمط العضوي المخيخي بعوامل ضارة بالحمض النووي للتصوير الفلوري لسلاسل PAR لتقييم استجابة الإجهاد السام الجيني

للبدء ، قم بزراعة الأنسجة المخيخية المفرومة المستخرجة من جرو فأر يبلغ من العمر 10 أيام في نسر متوسط قاعدي. أضف المواد الكيميائية الضارة بالحمض النووي مباشرة إلى وسط الاستزراع بتركيزات نهائية مناسبة. بعد فترة التعرض ، استبدل الوسط بوسط مختلط طازج يحتوي على المواد الكيميائية الضارة بالحمض النووي ومثبط جليكو هيدرولاز بولي ريبوز ADP ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، اغسل الشرائح بمحلول فوسفات 0.1 مولار في درجة حرارة الغرفة وثبتها على الفور بمزيج الأسيتون والميثانول المبرد مسبقا. احتضن الطبق لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. ثم قم بإزالة محلول التثبيت واغسله بمحلول فوسفات 0.4 مولار.

أضف 100 ميكرولتر من 0.1 مولار فوسفات إلى كل بئر من صفيحة 48 بئر. ثم استخدم مشرطا ولوح تقطيع لإزالة هوامش الإدخال ، وقطع حول شريحة الأنسجة. ضع الشريحة في بئر من طبق 48 جيدا.

بعد شفط المخزن المؤقت ، احتضان الملحق ب 100 ميكرولتر من 0.1 مولار فوسفات يحتوي على 1٪ Triton X100. قم بشفط المحلول واحتضان الملحق بشكل متسلسل في كل بئر على شاكر بكميات مناسبة من محلول الحجب متبوعا بالأجسام المضادة الأولية في الأجسام المضادة الثانوية. أضف 20 ميكرولترا من محلول DAPI النهائي إلى كل بئر قبل 20 دقيقة من نهاية الحضانة لمدة ساعتين مع الجسم المضاد الثانوي واستمر في الاهتزاز لمدة 20 دقيقة.

للتركيب ، ضع الأنسجة على شريحة زجاجية مجهرية بحيث يكون النسيج متجها لأعلى. أضف وسيط التثبيت وقم بتغطيته بغطاء زجاجي. ضع الشرائح على سطح مستو واتركها تجف طوال الليل في الظلام عند أربع درجات مئوية.

تم الحفاظ على أوراق المخيخ في الثقافة. تم تلطيخ خلايا بركنجي ل Calbindin D-28K والنوى العصبية الملطخة ل NeuN. تم تلطيخ الخلايا النجمية في خلايا بركنجي من أجل GFAP.

زاد تلطيخ PAR في خلايا بركنجي المعالجة بعد التعرض لبرومات البوتاسيوم والباراكوات مما يشير إلى تلف الحمض النووي.