لعزل الميتوكوندريا ، ضع الجرذ المقطوع الرأس المخدر في وضع الانبطاح على الجليد. بعد تعريض القلب، قم بقطع الشريان الأورطي حوالي أربعة إلى ستة ملليمترات فوق جذر الشريان الأبهري وأسفل نقاط التفرع السباتية. قم بتقنيد الشريان الأورطي وزرع القلب بمحلول شلل القلب المثلج باستخدام رأس ضغط يعتمد على الجاذبية حتى يتم تطهير الشرايين التاجية من الدم ويظهر العضو مبيضا.
قم بتشريح الأذينين والأنسجة الصمامية الغضروفية والأنسجة الدهنية لعزل عضلة القلب البطينية. افرم الأنسجة بمقص جراحي حاد حتى تصبح القطع حوالي ملليمتر مكعب واحد. انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد مسبقا ، المسمى الدوران الأول والثاني الذي يحتوي على محلول البروتياز
أضف عازلة عزل الجليد إلى الحجم النهائي البالغ 25 مل. باستخدام الخالط الثابت الدوار المحمول باليد ، قم بتفريق الأنسجة عند 18 ، 000 دورة في الدقيقة على الجليد لمدة 20 إلى 25 ثانية. الطرد المركزي للأنسجة المتجانسة عند 8 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المادة الطافية. وشطف الحبيبات برفق مع خمسة ملليلتر من العزل عازل لإزالة البروتياز المتبقي. بعد التخلص من الشطف ، أضف عازلة العزل المثلج إلى الحجم النهائي البالغ 25 مل.
ثم دوامة لتعليق الحبيبات. جهاز الطرد المركزي ، تتجانس الأنسجة عند 800 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. صب المادة الطافية التي تحتوي على الميتوكوندريا برفق في أنبوب 50 مليلتر مبرد مسبقا.
الآن قم بالطرد المركزي للطاف عند 8,000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات المحتوية على الميتوكوندريا. باستخدام منديل خال من النسالة ، امتص المادة الطافية الزائدة من الجدار الداخلي للأنبوب دون إزعاج الحبيبات وضع الأنبوب على الجليد.
أضف 80 ميكرولترا من عازل البرد المثلج إلى قاع الأنبوب وأعد تعليق الميتوكوندريا برفق باستخدام ماصة دقيقة. بمجرد إعادة التعليق ، انقل الميتوكوندريا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا. حدد تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة بروتين حمض الحركية البيسون.
في أنبوب الطرد المركزي الصغير المبرد مسبقا ، قم بتخفيف مخزون الميتوكوندريا إلى تركيز العمل المطلوب باستخدام عازل عزل. لاختبار جدوى وجودة عزلات الميتوكوندريا ، قم بتحميل 2.3 مل من عازلة التنفس في غرف الأوكسيغراف. اسمح لإشارة استهلاك الأكسجين بالتوازن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا أو حتى يقترب المعدل من الصفر.
عند التوازن ، ادفع السدادات لأسفل واستنشق المخزن المؤقت الزائد. باستخدام حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر ، أضف مليموليا واحدا EGTA لاستخلاص أي كالسيوم متبقي في مخزن التنفس على Oxygraph. لتغذية التنفس ، أضف خمسة مللي مولار بيروفات الصوديوم ، ومليمولار مالات واحد في المخزن المؤقت.
ثم أضف بلعة من الميتوكوندريا المخففة واترك التنفس يحدث لمدة خمس دقائق. عند علامة الخمس دقائق ، أضف بلعة 500 ميكرومولار ADP لبدء التنفس في الحالة الثالثة. لحساب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي ، اقسم الحد الأقصى لمعدل استهلاك الأكسجين خلال الحالة الثالثة على معدل استهلاك الأكسجين قبل إضافة ADP في الحالة الثانية.
لوحظت زيادة سريعة في استهلاك الأكسجين مباشرة بعد إضافة ADP مما يشير إلى البدء الناجح في الفسفرة المؤكسدة في الميتوكوندريا القلبية المعزولة. أظهرت الميتوكوندريا القلبية من خنازير غينيا وفئران سبراج داولي وفئران فيروس سرطان الدم B من Friend ، نسب تحكم عالية في الجهاز التنفسي ، مما يشير إلى جودة عزل الميتوكوندريا الجيدة. أظهرت الميتوكوندريا الكبدية والكلى من Sprague-Dawley Rats أيضا نسب تحكم تنفسية مقبولة تدعم العزلة الناجحة.
أظهرت خلايا HEK293 قيم نسبة التحكم في الجهاز التنفسي أعلى من العتبة المقبولة ، مما يؤكد جودة عزل الميتوكوندريا عن هذه الخلايا.
