تركيب ومعالجة أنسجة قنافذ البحر لقياسات الفحص المجهري للقوة الذرية في أنسجة الأطراف المتجددة والسليمة

لتحضير أسطوانات بطول سنتيمتر واحد بقطر سنتيمتر واحد ، قم بتسخين قاطع من الورق المقوى تحت لهب موقد بنسن ، وقم بقطع أنبوب سعة 15 مليلتر بالشفرة الساخنة. قم بتغطية جانب واحد من الأسطوانات بقطع بارافيلم بعد تخدير قنافذ البحر والتأكد من عدم استجابته للمنبهات اللمسية ، قم بتوجيه الطرف بشكل عمودي على محور الجسم.

بتر الطرف على الفور بعيدا عن المنطقة المتكلسة في منطقة zeugopodial. أعد قنافذ البحر إلى خزان يحتوي على مياه عذبة مع المسكنات. بعد 24 ساعة ، انقل قنافذ البحر مرة أخرى إلى الماء العذب واترك الطرف يتجدد حتى المرحلة المطلوبة من الاهتمام.

بعد وضع قنافذ البحر المخدر تحت مجهر استريو ، قم بقياس طول الطرف في المرحلة المطلوبة من التجديد لمراحل التحلل النسيجي والتكثيف للغضاريف. بعد جمع الأطراف ، ضعها في طبق بتري للتشريح. تحت مجهر ستيريو ، قم بتشريح الأطراف بمشرط على مستوى الكوع ، وضعها في طبق بتري يحتوي على محلول APBS.

رتب ماصات باستور ومجموعة الكتلة الحرارية على 37 درجة مئوية مع حصص الاغاروز على منصة العمل. قم بإزالة الكتلة الباردة من الفريزر تحت الصفر 20 درجة مئوية وضع الأسطوانة بحيث يكون الطرف المغطى بالبارافيلم متجها لأسفل فوقها. ضع الطرف على طبق نظيف وقم بإزالة السائل الزائد برفق من الطرف المقطوع باستخدام المناديل الورقية.

أضف نقطة الانصهار المنخفضة الذائبة في الأعلى ، وحرك الطرف لفترة وجيزة في الاغاروز لإزاحة أي APBS متبقية من سطح الجلد. ضع الطرف بسرعة داخل الأسطوانة ، مع التأكد من توجيهه عموديا بحيث تكون منطقة الاهتمام متجهة لأعلى. أضف نقطة انصهار منخفضة من agarose داخل الأسطوانة حتى يتم تغطية الأنسجة بالكامل.

بعد ذلك ، قم بإزالة الأسطوانة من الكتلة الباردة واترك الاغاروز يتصلب لمدة 30 ثانية. بعد التصلب ، قم بإزالة البارافيلم من قاع الأسطوانة وقم بتوصيل الأنسجة المحتوية على الاغاروز بمرحلة الاهتزاز باستخدام غراء سيانواكريلات. ثم قم بإزالة أي فائض من الاغاروز المحيط بمشرط.

غمر المرحلة في حل APBS للتقسيم. ابدأ في تقسيم الاغاروز في خطوات 100 ميكرومتر حتى يتم الوصول إلى طرف الأنسجة. ثم قم بقسمه حتى تتم إزالة الجزء البعيد من الأنسجة.

باستخدام شفرة حلاقة ، قم بإزالة كتلة الاغاروز المحتوية على الأنسجة بعناية من مرحلة الاهتزاز. على الفور ، قم بتوصيل الكتلة بطبق بتري بلاستيكي مقاس 35 ملم مع غراء لاصق للأنسجة الجراحية. أضف ما يقرب من ملليلترين من وسط الثقافة لتغطية الأنسجة.