للبدء ، قم بقص الشبكات المعدنية إلى شرائح بقياس 25 × 8 ملم. ضع الشبكات المخصصة في حاوية تعقيم وأوتوكلاف لمدة ساعتين. بعد التعقيم ، ضع حاوية التعقيم وقوارير 1.8 مل تحت مقعد التدفق الرقائقي.
افتح حاوية التعقيم وقم بإزالة الشبكة المعدنية. ضع الشبكة في غطاء القارورة سعة 1.8 مليلتر وأغلق القارورة. بعد جمع أنسجة قشرة المبيض البشرية ، قم بإزالة النخاع وقطع الأنسجة إلى الأشكال المرغوبة.
أضف خمسة ملليلتر من محلول التزجيج 1 في البئر الأول من الصفيحة المكونة من ستة آبار. باستخدام مصفاة الخلية ، قم بموازنة أنسجة قشرة المبيض لمدة خمس دقائق في البئر 1 من اللوحة. انقل مصفاة الخلية بأنسجة القشرة إلى البئر 2 التي تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول التزجيج 2 وتوازن لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، ضع المصفاة التي تحتوي على أنسجة القشرة في بئر 3 من صفيحة من ستة آبار ، تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول التزجيج 3 لمدة ست دقائق. املأ قارورة التبريد المحضرة بالنيتروجين السائل المعقم وضعها في وعاء cryo dewar المملوء بالنيتروجين السائل. قم بتحميل عينات الأنسجة على الشبكة المعدنية لجهاز التزجيج في غضون دقيقة واحدة.
ثم أدخل الشبكة المعدنية في النيتروجين السائل في قارورة التبريد القائمة على الشبكة. أضف ستة ملليلتر من محلول التوازن إلى البئر 1 من صفيحة معقمة مكونة من ستة آبار ، ثم انقل ستة ملليلتر من RS ، كل منها إلى الآبار 2 و 3. احتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
قم بتسخين محلول التسخين السريع في دورق عينة معقم لمدة ساعة واحدة على لوح تسخين على درجة حرارة 37 درجة مئوية. تحت مقعد التدفق الرقائقي ، افتح القوارير المحفوظة بالتبريد التي تحتوي على أنسجة قشرية المبيض المزججة. انقل الشبكة بسرعة إلى محلول الاحترار السريع.
باستخدام ملقط معقم ، انقل الأنسجة إلى محلول التوازن واحتضانها لمدة ثلاث دقائق على شاكر هزاز. بعد ذلك ، اشطف المنديل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق باستخدام كل منهما RS1 و RS2 على شاكر هزاز. قم بإذابة الكالسين في 100 ميكرولتر من DMSO.
انقل ثلاثة ميكرولترات من الكالسين إلى قاع أنبوب سعة 1.5 مليلتر واحفظه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. أضف 0.007 جرام من الكولاجيناز في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتخزين الأنبوب عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. أضف 997 ميكرولترا من DPBS إلى ثلاثة ميكرولترات من الكالسين المجمدة وأعد تعليقها لإذابة الكالسين.
ثم أضف مسحوق الكولاجيناز البارد للحصول على 1000 ميكرولتر من محلول العمل. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول الكالسين العامل وانقل قطعتين من ملليمترين من شظايا قشرة المبيض إلى آبار طبق بأربعة آبار. ثم احتضن لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، للحماية من الضوء.
أخيرا ، تحت المجهر الفلوري ، حدد صلاحية البصيلات.
