للبدء ، قم بتغطية إدخالات Transwell ب 42 ميكرولتر من 0.05٪ Matrigel. احتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية للسماح ل Matrigel بالضبط. استنشق الوسط الإضافي وجفف Transwells لمدة 30 دقيقة مكشوفة.
ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط DMEM F12 إلى كل ملحق واحفظه على حرارة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. اغسل فطائر Matrigel التي تحتوي على العضيات باستخدام PBS. قم بتعريضها ل 500 ميكرولتر من استعادة الخلايا أثناء وجودها على الجليد ، وقم بماصة الخليط بشكل متكرر لضمان مجموعة كاملة من الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلترا.
ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في الحجم المستهدف للخلايا الجذعية الظهارية المعوية أو وسط IESC. الآن ، قم بتغطية حقنة سعة ملليلتر واحد مسبقا في وسط IESC ، واستنشق تعليق الخلية من خلال إبرة قياس 16.
ثم استبدل الإبرة قياس 16 بإبرة قياس 28 وأخرج التعليق لتعزيز فصل العضيات. بعد ذلك ، ضع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية الناتج في الجانب القمي من Transwells المطلي. أضف 500 ميكرولتر من وسيط IESC وعوامل النمو إلى الجانب القاعدي.
استخدم غرفة قياس TEER ذات القطب المزدوج لتحديد كمية TEER عبر الطبقات أحادية. املأ كوب الثقافة ب 1.5 مل من وسائط IESC وتأكد من وجود 200 ميكرولتر من الوسائط بالضبط في ملحق Transwell ، بحيث تتطابق مستويات السوائل أثناء القياس. كشف الجانب القاعدي الجانبي لإدخالات Transwell إما للسيتوكينات الالتهابية من إنترلوكين -1 بيتا أو المنتجات الدبقية من الثقافات المعرضة للإنترلوكين -1 بيتا.
قم بقياس TEER كل 10 إلى 15 دقيقة لمدة 45 دقيقة عن طريق وضع كل Transwell في كوب الاستزراع. أدى التعرض القاعدي للوسائط من المزارع الدبقية المعالجة ب 10 و 25 نانوغراما من إنترلوكين -1 بيتا إلى زيادة نفاذية الحاجز الظهاري بشكل كبير. لم يلاحظ أي زيادة كبيرة في نفاذية الظهارة بعد التعرض للخيول إنترلوكين -6 عبر تركيزات مختلفة.
