للبدء ، قم بتغطية 24 لوحا جيدا بمحلول الطلاء واحتضانه لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأطباق مرتين بالماء المعقم واحفظها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح الخلايا جاهزة للطلاء. الآن خذ جزءا من الصائم الحصان وضعه في محلول جرس بارد على الجليد.
قم بإزالة جزء طوله 10 سنتيمترات من الصائم وافتحه عند الحدود المضادة للمساريقية ، مع وضع المناطق غير اللمفاوية في المركز. ثم قم بقص الجزء إلى قسم يبلغ طوله سبعة × سبعة سنتيمترات تقريبا ، واشطف الأنسجة جيدا في محلول رنين جديد قبل التشريح. الآن قم بتثبيت الأنسجة على طبق بتري مطلي بالسيليكون المطاط الصناعي في محلول رنين بارد ، أو PBS ، مع الجانب المخاطي لأعلى ، مع تمديده قدر الإمكان.
باستخدام ملقط منحني ، قم بإزالة الزغابات المعوية ، ثم قم بإزالة طبقة الصفيحة الخاصة من المنطقة غير اللمفاوية التي يبلغ طولها خمسة × خمسة سنتيمترات تقريبا. بعد ذلك ، باستخدام مقص التشريح الدقيق ، قم بإزالة الغشاء المخاطي في ورقة واحدة عن طريق تحريره في زاوية واحدة. لاحظ الفصل الطبيعي أثناء تقشير تحت الغشاء المخاطي من الطبقة العضلية الدائرية الداخلية.
ثم افرم الطبقة تحت المخاطية المجمعة إلى قطعتين إلى خمسة ملليمترات. ضعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، يحتوي على خمسة ملليلتر من الأورغونو بدون FBS ، والكولاجيناز ، والبروتياز ، و BSA. احتضان الأنسجة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية للهضم الأنزيمي.
بعد الحضانة ، أضف 10 ملليلتر من الأورغونو بدرجة حرارة الغرفة مع FBS لإيقاف عمل الإنزيم. ماصة خليط الأنسجة لأعلى ولأسفل 15 مرة باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لفصل الخلايا عن الأنسجة. ثم الطرد المركزي الخليط على حرارة 3000 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل 15 مرة باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر. الطرد المركزي الأنبوب المخروطي عند 3000 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الأورغونو بدرجة حرارة الغرفة باستخدام FBS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 15 مرة.
بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا بالتتابع من خلال مصفاة خلية بحجم المسام 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر. بعد الطرد المركزي للخلايا والتخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في مليلتر واحد من الأورغونو باستخدام FBS. ثم قم بتلطيخ الخلايا باللون الأزرق المثقب لتحديد الخلايا الحية وحسابها باستخدام مقياس كثافة الدم.
الآن زرع ما يقرب من 400،000 خلية في 300 ميكرولتر من الأورغونو مع FBS في كل بئر من 24 لوحة بئر. أضف خمسة ميكرولترات من N2 ، وخمسة ميكرولترات من G5 ، و 10 ميكرولترات من B27 لكل بئر. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بالتصاق الخلية.
عندما تصل الخلايا من الممر الأول إلى 70 إلى 80٪ من التقاء ، قم بتعريض الآبار لصفر و 10 و 25 نانوغرام من إنترلوكين -1 بيتا لمدة 24 ساعة. لوحظت خلايا على شكل مغزل متوافقة مع مورفولوجيا الدبق المعوي في الثقافات ، مع تعدد الأشكال والحد الأدنى من التلوث من أنواع الخلايا الأخرى.
