للبدء ، قم بإعداد جزيئات الحمض النووي الريبي النانوية المزدوجة التي تقطعت بها السبل في الشيتوزان لتغذية يرقات دودة القز. ثم اختر يرقات دودة القز المبتدئة المتأخرة ذات الحجم المماثل لتجربة التغذية. ضع كل يرقات على حدة في بئر من ستة آبار.
غطي الطبق وجويع اليرقات لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، اشطف أوراق التوت الطازجة بالماء منزوع الأيونات وجففها باستخدام ورق مطبخ نظيف. قطع الأوراق المجففة بالكامل إلى سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد أقراص ورقية.
قم بإذابة جزيئات الحمض النووي الريبي النانوية للكيتوزان في ماء خال من النوكلياز بتركيز 500 نانوجرام لكل ميكرولتر قبل الاستخدام. قم بتغطية 10 ميكرولترات من الجسيمات النانوية للشيتوزان dsRNA ، والتحكم في جزيئات الشيتوزان النانوية ، و dsRNA العاري بشكل منفصل على سطح كل قرص أوراق التوت. دع المحاليل تجف في الهواء على أقراص الأوراق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، قدم قرصا ورقيا واحدا مطلي بالجسيمات النانوية أو مغلفا ب dsRNA لكل يرقات كل يوم. بمجرد أن تستهلك اليرقات قرص الأوراق المطلي بالكامل ، قم بتوفير أوراق التوت الطازجة كل يوم. في اليوم السادس ، ضع اليرقات على الجليد حتى تصبح غير قادرة على الحركة.
لتشريح اليرقات ، اقطع الصدر بالمقص على طبق بتري نظيف واستخدم الملقط لسحب الأمعاء الوسطى. بعد إزالة المحتويات. اغسل الأمعاء الوسطى في طبق بتري بالماء الخالي من النوكلياز.
قم بتجميد الأمعاء الوسطى عند 70 درجة مئوية تحت الصفر في أنبوب سعة 1.5 مل. أدى تغذية جزيئات الحمض النووي الريبي النانوية للشيتوزان في ديدان القز إلى انخفاض بنسبة 79٪ في مستويات نسخ BmToll9-2 مقارنة بعلاجات التحكم. كانت يرقات دودة القز المعالجة بالجسيمات النانوية للكيتوزان dsRNA الصامدة BmToll9-2 أصغر بشكل واضح من يرقات التحكم.
كانت شرانق اليرقات الصامتة BmToll9-2 أصغر بكثير من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة.
