للبدء ، ضع أنبوبا سعة 50 ملليلترا على الثلج وأضف محلول الكولاجين مع المكونات الأخرى بالتتابع. رج الأنبوب لخلطه جيدا. باستخدام ماصة P10، أضف محلول هيدروكسيد الصوديوم المولي بالتنقيط أثناء رج محلول المزيج لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3.
أضف 1.25 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى خليط الكولاجين المكون من خمسة ملليلتر واخلط المحلول برفق. بعد ذلك ، ضع طبقا مكونا من 12 بئرا على الثلج لمدة دقيقتين. باستخدام أطراف التجويف العريضة ، أضف خليط مصفوفة الكولاجين المكون من غشاء القاعدي ببطء إلى الطبق المكون من 12 بئرا.
ضع الصفيحة المكونة من 12 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لترسيخ الطبقة الأولى من الهيدروجيل. احتفظ بخليط مصفوفة الكولاجين المتبقي على الثلج لاستخدامه لاحقا. ثم انقل ما يقرب من 60 مجاميع خلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
وتبريد الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق. باستخدام طرف ماصة P200، قم بإزالة الوسيط بعناية من الأنبوب. أضف 1.5 مل من خليط غشاء الكولاجين الواحد ، بالتنقيط إلى مجاميع الخلايا ، واخلطها برفق باستخدام طرف ماصة P200 واسع التجويف لإعادة التعليق.
انقل اللوحة مع الطبقة الأولى من الهيدروجيل من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية. أضف 1.5 مل من معلق الركام على طبقة الهيدروجيل المعالجة ورج اللوحة برفق لتوزيع الركام بالتساوي. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين.
وسط تمايز الأوعية الدموية الدافئ اثنان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف ملليلترين من الوسط إلى كل بئر وقم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسط كل ثلاثة أيام باستخدام وسيط تمايز الأوعية الدموية الطازج الدافئ مسبقا.
عبرت العضيات عن CD31 و ERG1 و PDGFR beta ، مما يشير إلى وجود خلايا وطفيليات بطانة الأوعية الدموية. تم تصور شبكات الأوعية الدموية عبر الفحص المجهري المناعي الكامل بعد إزالة الأنسجة. أظهرت العضيات الناضجة الملطخة في اليوم 17 شبكات الأوعية الدموية التي تغلف الكرات داخل كتلة الهلام.
كانت العضيات التي تم استردادها في اليوم 28 تحتوي على شبكات وعائية تلتف حول الكرويات بدلا من التمدد شعاعيا.
