للبدء ، ضع أنسجة الفأر المستخرجة في أنبوب طاحونة الأنسجة الذي يحتوي على 50٪ محلول ملحي مثلج و 50٪ ميثانول. أدخل المدقة في أنبوب المطحنة وقم بتدويرها برفق خمس مرات لتجانس الأنسجة. انقل الأنسجة المتجانسة على الفور إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا.
أضف ملليلترين من الميثانول ومليلتر واحد من 0.1 مولار هيدروكسيلامين إلى العينة المتجانسة. اتركي الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لاستخراج الريتينويد ، أضف 10 ملليلتر من الهكسان إلى التجانس ودوامة الأنبوب أفقيا لمدة 10 ثوان على الأقل.
الطرد المركزي خليط الهكسان المتجانس لمدة ثلاث دقائق عند 1000 × جم لفصل المراحل. باستخدام ماصة ، انقل طبقة الهكسان إلى أنبوب زجاجي منفصل سعة 15 مليلتر وضع العينة في جهاز طرد مركزي مفرغ لتبخير الهكسان تماما من العينة المستخرجة. أعد تعليق الرتينويدات المجففة في أنبوب سعة 15 مليلتر مع 100 ميكرولتر من الهكسان والدوامة جيدا لضمان إذابة جميع الريتينويدات.
ماصة 100 ميكرولتر من الهكسان بالكامل في الأنبوب الزجاجي الثاني ودوامة الأنبوب لإذابة الرتينويدات. ثم قم بتقطيع 100 ميكرولتر من الهكسان بالكامل إلى زجاج واحد خامل لتحليل HPLC. قم بإعداد تشغيل HPLC باستخدام الشروط المناسبة.
تحديد القمم باستخدام أوقات الاستبقاء وأطياف الأشعة فوق البنفسجية لكل ريتينويد ذي أهمية بناء على المعايير. باستخدام نظام البيانات الكروماتوغرافية ، قم بدمج القمم المحددة والإشارة إلى المنحنى القياسي الخارجي لتحديد كمية المادة التحليلية. بالنسبة للمخططات الكروماتوغرامية للأنسجة البيولوجية ، قم بدمج القمم يدويا لحساب التغيرات في أوقات الاحتفاظ.
في الكروماتوجرام لعين الفأر الضابطة ، تم تحديد 13-cis-retinal و 11-cis-retinal و all-trans-retinal و 11-cis-retinol و all-trans-retinol. في الكروماتوجرام لعين الفأر المعالجة بالهيدروكسيلامين ، زادت أوقات الاحتفاظ. كانت الأيزومرات المتزامنة والمضادة لهذه الريتينالديهايدات موجودة أيضا.
في الكروماتوجرام للأنسجة الكبدية للفأر ، تم تحديد بالميتات الريتينيل والريتينول المتحول بالكامل على أنهما الأشكال الرئيسية لفيتامين أ ، وأظهر ذلك في دم الفأر ذروة عبر الريتينول. أكدت أطياف الأشعة فوق البنفسجية الماصة وجود الأشكال الإسوية للريتينويد في قمم الكروماتوغرام.
