وأيد العمل التي أعلن عنها في هذه المادة من قبل الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) في أستراليا برنامج المنحة (CRP) ومشروع NHMRC غرانت (CRP وBJCQ). كما BJCQ زميل بيتر دوهرتي NHMRC ما بعد الدكتوراه.

1) إعداد الكاشف الأسهم CFSE 1.1) الحل ويتم شراء الصبغة CFSE كما ثنائي الأسيتات carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFDA ، SE) (MW 557.47 غ / مول) ، وعادة في قوارير 25 ملغ. حل ملغ في 25 مل 8،96 DMSO للتوصل إلى حل نهائي الأسهم من 5 ملم (5-10 المخزن كما aliquots ميكرولتر في -20 درجة مئوية لعدة أشهر). سوف CFDA ، SE تتفاعل مع محلول مائي ولذلك فمن الأهمية بمكان أن يتم تجنب التعرض لمثل هذه أثناء التخزين. 1.2) الخلايا اللمفاوية عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال والغدد الليمفاوية أو من الفئران وresuspend في 1 مل من مستنبت (مثل RPMI) مع 5 ٪ للحرارة المعطل (مرحبا) الجنين مصل العجل (FCS) ، مع تركيز خلية من بين 0.5 × 10 6 -- 10 × 10 / 7 مل. 2) وضع العلامات CFSE 2.1 الطريقة الروتينية) : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا بدقة في حجم 1 مل من المتوسط ​​والمكان بعناية في الجزء السفلي من أنبوب الطازجة (غير المبللة) مخروطية 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب أفقيا (باستخدام أنبوب غير المبللة سيمنع 1 مل خلية تعليق من التحرك قبل الأوان والاختلاط مع حلول CFDA SE ،). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بعناية ميكرولتر من 110 برنامج تلفزيوني إلى الجزء غير المبللة من البلاستيك في الجزء العلوي من الأنبوب الحرص على ان لا يجعل الاتصال مع الحل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 1.1 ميكرولتر من المخزون 5 مم من CFDA ، SE في برنامج تلفزيوني 110 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غطاء الأنبوب ، وسرعان ما قلب الدوامة ، وكذلك للحصول على خلط موحد سريع للحلول. لاحظ أن الصبغة CFSE هو في التركيز النهائي من 5 ميكرون ، ومع ذلك ، قد تركيز الأمثل يجب أن تكون مصممة لاستعداد كل دفعة ، ودققت ثم كل 6 أشهر للتأكد من أنه غير فعال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أنه عند التحويل من CFDA ، SE إلى CFSE (انظر المناقشة) صبغة الفلورسنت ويصبح عرضة للتبيض وبالتالي التعرض للضوء المفرطة. وبالتالي ، فإنه من المستحسن لحماية أنبوب من الضوء من هذه النقطة ، على سبيل المثال عن طريق تغطية ذلك مع احباط الالومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا تمييع في 10 مجلدا من 20 درجة مئوية PBS تحتوي على 5 ٪ FCS مرحبا ، المترسبة بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية ، ونبذ طاف. تكرار غسل كميات أكبر من مرتين. </li></ol> 2.2 الأسلوب البديل) ، الذي هو أيضا مناسبة للأرقام أعلى الخلية (10 -- 30 × 10 7) : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 × (10 ميكرومتر) CFDA حل SE ، وذلك بإضافة 2 ميكروليتر من المخزون ملي 5-1 مل من برنامج تلفزيوني وبسرعة إضافة إلى هذه الخلايا 1 مل من معلق جيدا ، ثم سرعان ما غطاء الأنبوب وقلب الدوامة ، وكذلك للحصول على سريع موحدة الخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل كما في الخطوات 2.1 (و) و 2.1 (ز). </li></ol> ويمكن عندئذ 2.3) خلايا يمكن تطبيقها على بروتوكول لمصلحة لتحريض انقسام الخلايا. ويمكن استخدام الخلايا المسمى في كل من في المختبر والمجراة في المقايسات. 2.4) عند الانتهاء من الفحص الانتشار ، ويتم حصاد الخلايا وتحليلها من قبل التدفق الخلوي (أنظر أدناه للاطلاع على نماذج تمثيلية). نتائج الممثل 3) لتقييم انتشار الخلايا اللمفاوية التي CFSE التخفيف ، فإنه من المفيد أن نعرف مضان من الخلايا غير مقسمة (أي الحد الأقصى مضان) وغير المسماة خلايا (أي مضان الحد الأدنى). لذا ، ينبغي أن التصميم الخاص بك تجريبية تأخذ هذه الضوابط في الاعتبار. فيما يلي أمثلة من في المختبر والمجراة في المقايسات CFSE به لقياس CD8 + T انقسام الخلية التي التدفق الخلوي. 3.1) في المختبر التحفيز الشكل 1 يوضح ملامح CFSE من CFSE المسمى ovalbumin (OVA) محددة وراثيا مستقبلات الخلية تي CD8 + T OT - I الثقافة الخلايا بعد 3 أيام مع الخلايا الجذعية نابض مع كميات مختلفة من OVA. CD8 + وصفت الخلايا التائية تنقيته من العقد اللمفاوية والطحال من OT - I مع الفئران وCFSE 1 × 10 5 الخلايا المستزرعة مع 3.3 X 4 10 DC. العاصمة حيث نابض مع OVA : 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، وقبل غسلها مرتين في الثقافة. بعد 3 أيام ، حيث تحصد الخلايا وصفت المضادة للCD8 - APC الأضداد وهويشت 33258 ومن ثم تحليلها من قبل التدفق الخلوي (50،000 الأحداث التي تم جمعها). يعيش (هويشت 33258 --) ترد CD8 + الخلايا. والضوابط ، CD8 + الخلايا التائية المثقف وحده ، ويبين شدة CFSE من الخلايا غير المنقسمة ، في حين أن خلايا غير المسمى يبين لصناعة السيارات في مضان من الخلايا وحدود كشف الانقسامات الخلوية. علما أنه يمكن رؤية قمم CFSE 4 في كل من لوحات في هذا المثال ، تشير إلى أن الخلايا قد خضعت تصل إلى 3 أقسام. 3.2) في تحفيز الجسم الحي الشكل 2 يوضح ملامح CFSE من CFSE المسمى OVA محددة مستقبلات الخلايا التائية CD8 + المعدلة وراثيا OT - I T الخلايا بعد 3 أيام في الجسم الحي طن وجود OVA 20 ميكروغرام. CD8 + وصفت الخلايا التائية تنقيته من العقد الليمفاوية والطحال من الفئران CD45.1 OT - I مسانج مع CFSE و 5 × 10 6 خلايا حقن في الوريد الرابع الذيل الوحشي C56BL/6J (CD45.2 +) الفئران. بعد ساعة 2 الفئران تم حقن الرابع مع 20 ميكروغرام من OVA. بعد 3 أيام ، وجمعت الطحال من الفئران ، وتقدم الى تعليق خلية واحدة ، وصفت المضادة للB220 - PerCP ومعاداة CD8 - APC - Cy7 ومعاداة CD45.1 - PE - Cy7 الأضداد وهويشت 33258 وتحليلها ثم من جانب التدفق الخلوي (1،000،000 الأحداث التي تم جمعها). يعيش (هويشت 33258 --) ترد B220 - الخلايا في اللوحة اليسرى وبوابات CD8 + + CD45.1 الخلايا هو موضح في اللوحة اليمنى. والضوابط ، unstimulated CFSE المسمى CD8 + الخلايا التائية ، ويبين شدة CFSE من الخلايا غير المنقسمة ، في حين أن خلايا غير المسمى يبين لصناعة السيارات في مضان من الخلايا وحدود كشف الانقسامات الخلوية. علما بأن استخدام الفرق CD45 النمط الخيفي أمر حيوي في حل CD8 + نقل خلايا تي من المضيف ، لأنها هي مجموعة فرعية بسيطة من مجموع الخلايا التائية CD8 + (اللوحة اليسرى). علما أن معظم الخلايا تقع ضمن الحدود القصوى CFSE 7 في هذا المثال (اللوحة اليمنى) ، مشيرا إلى أن الخلايا قد خضعت تصل إلى 6 أقسام. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. قدرة CFSE المسمى ovalbumin (OVA) محددة T الخلايا المعدلة وراثيا مستقبلات CD8 + OT - I الخلايا التائية للرد في المختبر إلى العاصمة نابض مع تركيزات مختلفة من OVA ، وبيانات أظهرت أن بعد الثقافة 3 أيام. ملاحظة T + غير مقسمة سكان CD8 الخلايا في حالة عدم وجود مستضد (رمادي فاتح الرسم البياني) ، وصناعة السيارات في مضان من السكان غير المسمى (الرسم البياني الرمادي الداكن). يصور الشكل CD8 + الخلايا التائية التي قسمت 1-3 مرات على أساس تخفيف CFSE القمم ، مع المزيد من الخلايا T تقسيم في تركيزات أعلى مستضد. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. قدرة CFSE المسمى ovalbumin (OVA) محددة مستقبلات الخلايا التائية وراثيا CD8 + OT - I الخلايا التائية ، عندما نقل adoptively في الفئران C57BL / 6 للرد على OVA ، بيانات أظهرت 3 أيام بعد نقل بالتبني اللوحة اليسرى : CD8 + ، CD45. 1 + الخلايا T - 1 بعد التمديد في الفئران المتلقية. اللوحة اليمنى : CFSE ملف الانتشار النووي. علما غير ينقسم السكان من الخلايا التائية CD8 في الفئران لا يتلقى المستلم مستضد (رمادي فاتح الرسم البياني) ، وصناعة السيارات في مضان من الخلايا الليمفاوية غير المسمى (الرسم البياني الرمادي الداكن) +. يصور الشكل CD8 + الخلايا التائية التي قسمت 1-6 مرات على أساس تخفيف CFSE القمم. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تمثيل الأحداث الجزيئية المختلفة التي تحدث أثناء توسيم الخلايا مع ثنائي الأسيتات carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFDA ، SE). للاطلاع على تفاصيل عملية مناقشة انظر النص. يستخدم &#39;CFSE&quot; إن اختصار عامة ، وليس CFDA ، SE ، لوصف كاشف التوسيم وإجراءات وضع العلامات بشكل عام : المذكرة. الرقم استنادا باريش 4.

<ol>
	<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).</li><li>Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+intracellular+fluorescent+dye+CFSE+to+monitor+lymphocyte+migration+and+proliferation.">Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation.</a> Current protocols in immunology. , (2009).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لكي نقدر كيف ولماذا تعمل CFSE مطلوب السريع وسم موحدة لاستخدامها في تحليل انتشار الأسلحة النووية ، فإنه من المفيد لفهم الأساس الجزيئي للخلايا CFSE الوسم. ويمكن تقسيم هذه إلى مرحلتين ، 1) دخول الخلية و2) وضع العلامات البروتين (الشكل 3). 1) دخول الخلية : هو بوساطة دخول الصبغة إلى الخلية بواسطة النموذج diacetylated للصباغة ، carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFDA ، SE). والأسيتات جعل الصبغة نفيذ غشاء يسمح للغاية التمويه السريع عبر غشاء البلازما. Esterases والحاضر داخل الخلية ، ويلتصق من الأسيتات CFDA ، SE ، وبالتالي تؤدي إلى النموذج CFSE للصباغة الذي هو أقل بكثير نفيذ الغشاء ، وبالتالي التركيز على الصبغة داخل الخلية. 2) وضع العلامات البروتين : في حين أن كلا CFDA ، SE وCFSE الأمينية والتفاعل سلاسل الجانب succinimidyl ، فقط هو CFSE الفلورسنت. تركيز عال من الخلايا CFSE يسهل السريع وارتفاع مستوى الخلايا وسم من البروتينات. ويجب أن يؤدي وضع العلامات CFSE من الخلايا بسرعة من أجل الحصول على السكان المسمى متجانس من الخلايا ، وهو أمر حاسم لتسوية الخلايا التي تعرضت لانقسامات عدة كما هو موضح في نتائج ممثل (الشكل 1 و 2).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CFDA,SE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope Laboratories Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocytes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eg mouse or human</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10-15ml conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon, Becton Dickinson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminium foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Capral Aluminium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf (5810 R)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LSR-II (BD Biosciences)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (cfse) to monitor lymphocyte proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) هو وسيلة فعالة لرصد والشعبية لمفاوية 1-3 الانقسام. CFSE التسميات تساهميا المعمرة الجزيئات داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت ، carboxyfluorescein. وهكذا ، عندما خلية CFSE المسمى القسمة ، وهبوا ذرية مع نصف عدد carboxyfluorescein الموسومة الجزيئات ، وبالتالي يمكن تقييم كل انقسام الخلايا عن طريق قياس انخفاض مماثل في مضان الخليوي عبر التدفق الخلوي. قدرة CFSE لتسمية السكان اللمفاويات مع كثافة عالية من التباين الفلورية منخفضة بشكل استثنائي ، إلى جانب خلية سميتها منخفضة ، تجعل من صبغة مثالية لقياس انقسام الخلايا. نظرا لأنه هو صبغ فلوريسئين المستندة كما أنه متوافق مع مجموعة واسعة من fluorochromes الأخرى مما يجعلها تنطبق على التدفق الخلوي متعددة الألوان. توضح هذه المقالة الإجراءات التي تستخدم عادة لوضع العلامات اللمفاويات الماوس لغرض رصد ما يصل إلى 8 الانقسامات الخلوية. ويمكن استخدام هذه الخلايا المسمى على حد سواء لفي التجارب المختبرية والدراسات المجراة.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation at JoVE.com

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE التسميات تساهميا المعمرة الجزيئات داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت ، carboxyfluorescein. على هذا النحو ، وعندما خلية CFSE المسمى القسمة ، وعلى آله ونصف كمية مضان ، والتي يمكن بالتالي استخدامها لتقييم انقسام الخلايا. توضح هذه المقالة الإجراءات التي تستخدم عادة لوضع العلامات اللمفاويات الفأر مع CFSE.

استخدام ثنائي الأسيتات Carboxyfluorescein Succinimidyl إستر (CFSE) لمراقبة انتشار الخلايا الليمفاوية

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

the-use-carboxyfluorescein-diacetate-succinimidyl-ester-cfse-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

91.4K Views.  John Curtin School of Medical Research, Australian National University. CFSE التسميات تساهميا المعمرة الجزيئات داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت ، carboxyfluorescein. على هذا النحو ، وعندما خلية CFSE المسمى القسمة ، وعلى آله ونصف كمية مضان ، والتي يمكن بالتالي استخدامها لتقييم انقسام الخلايا. توضح هذه المقالة الإجراءات التي تستخدم عادة لوضع العلا?...

Video: The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

الاصبع العصا منهجية أخذ عينات من الدم لتحديد بممارسة المستحثة الأبوطوزيس اللمفاويات

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

استخدام<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير لرصد تطور التجريبية ماوس عدوى الفيروس المضخم للخلايا في حديثي الولادة

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

باستخدام البروتينات الفلورية لرصد ديناميات Glycosome في المثقبيات الأفريقي

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

المناعي لمراقبة الخلوية امتصاص اللاكتوفيرين الإنسان ولها نشاط مضاد للفيروسات أسوشيتد ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

الكشف عن<em&gt; المثقبية البروسية</em&gt; التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...