وأيد هذا العمل من قبل مركز فلوريدا لأبحاث استئصال ورم من الدماغ، وA. بريستون ويلز الابن مركز للعلاج استئصال ورم من الدماغ والمعاهد الوطنية للصحة (1R21CA141020-01).

1. إعداد تعليق خلية واحدة ورم أرومي دبقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تأسيس Gliomasphere الثقافة والمحافظة باستخدام مقايسة neurosphere (NSA) والتي سبق وصفها 2،11،12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المناسب لالركض وgliomaspheres، تتم إزالة المتوسطة التي تحتوي على مجالات، وضعت في حجم الأنسجة المعقمة المناسبة أنبوب الثقافة، وطرد في 800 دورة في الدقيقة (110 غ) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجاهل طاف وبيليه معلق من المجالات في 1 مل من التربسين 0.05٪، وحضنت EDTA عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 3-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم استخدام حجم مساو من التربسين المانع فول الصويا لوقف النشاط التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وpipetted بلطف التعليق الخلية صعودا وهبوطا لضمان التجانس وتحييد الكامل للنشاط التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى يتم طرد تعليق الخلية في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تتم إزالة طاف ومعلق الخلايا في 1ml من NeuroCultNSC متوسطة القاعدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم خلط 10μl من التعليق وحيدة الخلية مع 90μl من اللون الأزرق التريبان لتنفيذ عدد خلايا. </li></ol> 2. تلطيخ مع الخلية تتبع استر Succinimidyl Carboxyfluorescein (CFSE) صبغة الفلورسنت الأخضر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الخلايا 1 مليون دولار لتكون الملون، ويتم إعداد 1 مل من كاشف تلطيخ بإضافة 1 ميكرولتر من 5 ملم صبغة خلية تتبع CFSE (مجسات الجزيئية، إينفيتروجن) إلى 1 مل من متوسطة NSC NeuroCult بصل لإعطاء تركيز تلطيخ النهائية من 5 ميكرومتر . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم خلط الكاشف تلطيخ الخلايا التي تحتوي على ما يرام حتى التجانس وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الحضانة، ويتم إعداد الجليد الباردة متوسطة NSC NeuroCult بصل كحل التبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإيقاف عملية تلوين، يتم إضافة كميات من حل بحوالي 5-10 التبريد الجليد الباردة إلى الخلايا CFSE محملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم طرد الحل في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ويتم تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الهو النقطة، يجب أن تظهر هناك لبيليه من الخلايا في أسفل الأنبوب مع لون مشرق الخضراء اللون، مما يدل على تلطيخ كانت ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الخلايا عن طريق resuspending بيليه في 1-2 مل من جديد متوسطة NSC NeuroCult بصل، الطرد المركزي في 800 دورة في الدقيقة لطاف ال 5 دقائق والتخلص. ويتكرر هذا الإجراء ما مجموعه ثلاثة يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثالث، ومعلق الخلايا في 1 مل من متوسطة NSC NeuroCult بصل ويتم تنفيذ عدد خلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومطلي الخلايا ثم CFSE الملون في قوارير معقمة زراعة الأنسجة في كثافة مناسبة [50000 خلية / مل] وضعت في الحاضنة 37 درجة C / مرطب 5٪ CO2. </li></ol> 3. تحميل CFSE التحقق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن رصد الخلايا في الثقافة مطلي NSA تحت المجهر الفلورسنت للتحقق من تلطيخ CFSE. في هذه المرحلة، كافة الخلايا تظهر اللون الأخضر الساطع (الشكل 1). بدلا من ذلك، قطرة من تعليق خلية منيمكن وضع الخلايا الملون CFSE على شريحة المجهر وساترة مغطاة لتصور الخلايا تحت المجهر الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويؤكد كذلك وضع العلامات الناجحة CFSE عبر التدفق الخلوي. ما يصل إلى 1-5 × 10 5 خلايا من كل مجموعة كافية للتحقق تلطيخ CFSE. وCFSE تحميل وتفريغ معلق الخلايا والخلايا السيطرة السلبية على التوالي في 1 X-PBS أو NeuroCult NSC متوسطة بصل لإجمالي حجم 500 ميكرولتر ووضعها في أنابيب FACS منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم ضبط قياس التدفق الخلوي بناء على تعليمات من دليل المستخدم للمعايير ذات الصلة. CFSE لديه الحد الأقصى الطول الموجي الإثارة من 492 نانومتر والحد الأقصى من 517 نانومتر الانبعاثات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا، يتم تشغيل خلايا التحكم تفريغ ويتم تسجيل أحداث حصلت في مبعثر إلى الأمام والجانب (FSC مقابل SSC) الرسم البياني والمخططات، والسكان الخلية الرئيسية هي بوابات (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبالمثل، يتم تحليل الخلايا CFSE تحميل باستخدام المعلمة نفسق المستخدمة لخلايا التحكم (الشكل 2B). </li></ol> 4. عزل بطيئة تقسيم [CFSE أي الإبقاء] السكان الخلية باستخدام نيون الفرز الخلية المنشط (FACS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على التقسيم، وانخفضت كثافة CFSE والخلايا hGBM تشكيل gliomaspheres التي تتكون من الخلايا العارضة مستويات مختلفة من الكثافة مضان أخضر (الشكل 3). عندما وصلت الى gliomaspheres متوسط ​​حجم ما يقرب من 150-200 ميكرون في القطر (ما يقرب من 5 إلى 10 أيام آخر تحميل CFSE اعتمادا على معدل النمو خلية الخط)، تتم إزالة المتوسطة التي تحتوي على مجالات، وضعت في ثقافة حجم الأنسجة المعقمة المناسبة أنبوب، وطرد في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم إعداد تعليق خلية واحدة كما هو موضح في الخطوات السابقة ومعلق الخلايا في برنامج تلفزيوني لعدد خلايا من أجل إعداد تعليق خلية ذات الكثافة تصل إلى 10 7 خلية لكل مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلفإيه resuspending الخلايا في حجم مناسب لPBS، يضاف يوديد Propidium (PI، سيغما، 500 ميكروغرام / مل) عند تركيز من 1 ميكرولتر / مل من تعليق خلية لاستبعاد الخلايا الميتة عندما يتم فرزها / تحليلها من قبل التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخدام اثنين 15 مل العقيمة زراعة الأنسجة التي تحتوي على أنابيب 1ML كل من اكتمال متوسطة NSC NeuroCult لجمع الخلايا مصنفة بطيئة تقسيم (خلايا CFSE الاحتفاظ) والخلايا سريعة الانقسام (خلايا CFSE تمييع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا، يتم تشغيل الخلية تعليق من مجموعة الخلايا المفرغة من خلال تدفق عداد الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم رسم الخلايا (الأحداث) على أساس مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) والمعلمات على حد سواء الجهد المعلمات تم تعديل بحيث يتم تضمين معظم الخلايا في مؤامرة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبعاد الخلايا الميتة أو المتضررة، يتم رسم الخلايا يعتمد على SSC مقابل PI تفاعل واحدة الخلية الحية السكان (PI سلبي). بوابات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، يتم تحديد عدد السكان خلية متجانسة على أساس Fمبعثر orward (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم رسم ثم متجانسة واحدة الخلية الحية السكان في الرسم البياني يعتمد على تردد الخلية مقابل كثافة CFSE تعيين على مقياس لوغاريتمي. يتم ضبط كثافة الليزر CFSE من أجل وضع إشارة سلبية بين 0 و 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نفس المعلمات واستراتيجية النابضة مماثلة، يتم تشغيل خلايا CFSE المسمى من خلال تدفق عداد الكريات وتحليلها (4C الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد ذلك، يتم تحديد عدد السكان بطيئا تقسيم الخلايا وإجمالي عدد السكان (أسرع تقسيم الخلايا) على أساس قدرتها على الاحتفاظ CFSE (CFSE عالية أعلى 5٪ وCFSE المنخفضة أسفل٪ 85، على التوالي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تصنيف هؤلاء السكان مختلفة من الخلايا في 15 مل العقيمة منفصلة أنابيب زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1ml من المتوسطة NSC كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وطرد الخلايا ثم تم الفرز في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجاهل طاف وبيليه معلق في APPROيتم تنفيذ حجم priate المتوسطة (اعتمادا على عدد من الأحداث المعزولة أو حجم بيليه)، وعدد خلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومطلي ثم الخلايا من مجموعات سكانية مختلفة مصنفة في 50،000 الخلايا في المليلتر في مناسبة معقمة الأنسجة قارورة الثقافة وضعت في الحاضنة 37 درجة CO2 C / مرطب 5٪ لمدة 5-10 أيام قبل أن يتم passaged متسلسل أو استخدامها لتجارب المصب. </li></ol> 5. ممثل النتائج بعد تحميل CFSE، وجميع الخلايا يقدم مضان مكثفة الأخضر تصور تحت المجهر (الشكل 1). ويمكن رؤية هذا اللون الأخضر ملون حتى بالعين المجردة (انظر الفيديو). تحليل هذه الخلايا مع التدفق الخلوي يظهر أيضا مضان أخضر مكثفة للغاية مقارنة مع الخلايا السيطرة (الشكل 2). على الخلايا CFSE الطلاء الذي تم تحميله في الثقافة neurosphere، تتكاثر هذه الخلايا وتشكيل 150-200 ميكرون gliomaspheres في 5-10 أيام. كما تتكاثر الخلايا، ر<html> موزعة بالتساوي بين انه صبغة الفلورسنت الخلايا الوليدة على الانقسامات، مما أدى إلى بمقدار النصف من شدة التألق مع كل انقسام الخلية. غير متجانسة وظيفيا Glioblastomas وتتكون من الخلايا المتكاثرة على نطاقات زمنية مختلفة. الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول تمكن واحد لتحديد وعزل الخلايا السريعة والبطيئة تقسيم بحكم قدرتها على تمييع أو الاحتفاظ CFSE على التوالي (الشكل 3، انظر أيضا الفيديو). تحليل التدفق الخلوي من gliomaspheres فصل المولدة من الخلايا CFSE محملة بالمقارنة مع الخلايا تفريغ يوضح خصائص متنوعة الاحتفاظ CFSE (الشكل 4). تقسيم الخلايا بسرعة (أسفل 85٪) أو بطيئة تقسيم الخلايا (أعلى 5٪ - CFSE عالية) gliomapshere معرض تشكيل القدرة عند تربيتها في ظروف الفحص neurosphere (الشكل 5). جوري 1 &quot;/&gt; الشكل 1. فصل الخلايا السرطانية مباشرة بعد التحميل مع صبغة CFSE. الخلايا يحمل اللون الأخضر يدل مشرق وضع العلامات الناجحة. التكبير الأصلية؛ 10 ×. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. CFSE تأكيد التحميل باستخدام التدفق الخلوي. A) خلايا المفرغة، B) تحميل CFSE الخلايا وC) مقارنة كثافة مضان CFSE في الخلايا المحملة مقابل تفريغ. لاحظ أن هناك عدة أوامر من حجم الاختلاف في كثافة مضان بين الخلايا وصفت والخالي من الملصقات. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. A gliomasphere ممثل المستمدة من خلية CFSE محملة 6 أيام بعد الطلاء. بعض الخلايا تظهر مشرقة جدا تلطيخ CFSE. التكبير الأصلية؛ 63 ×. <imز SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; بديل = &quot;الشكل 4&quot; /&gt; الشكل 4. الممثل تدفق الخلوي المؤامرات / المدرج الاحصائي لعزل الخلايا السريعة والبطيئة تقسيم 6 أيام بعد تلطيخ CFSE. A SSC تفاعل مقابل PI) FSC مقابل SSC لتبرهن للشعب الخلية بأكملها، B) لاستبعاد الخلايا الميتة أو التالفة، C) FSC مقابل SSC إلى بوابة لخلية حية متجانسة السكان، D) يوضح وجود خلايا CFSE الاحتفاظ 6 أيام بعد وضع العلامات CFSE كما يتضح من كثافة مضان أكبر مقارنة بالكنترول السلبي. الرسم البياني يبين أيضا أن شدة CFSE اضمحلت مع مرور الوقت. E) الرسم البياني عرض استراتيجية لتحديد الخلايا النابضة CFSE الاحتفاظ (أعلى 5٪) والخلايا CFSE تمييع (أسفل 85٪). <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> gliomaspheres الممثل الشكل 5. المتولدة من <stronز&gt; A) الخلايا سريعة الانقسام (CFSE الأقل) والخلايا B) بطيئة تقسيم (CFSE عالية). التكبير الأصلي: 10X 20X وعلى التوالي C) الممثل عدد خلايا تم الحصول عليها من سرعة أو بطء زراعة الخلايا المشتقة من تقسيم الوقت في المرور. P &lt;0.05، تي الاختبار. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> .

<ol>
	<li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability.">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li><li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide.">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li><li>Pece, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content.">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Roesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporarily+distinct+subpopulation+of+slow-cycling+melanoma+cells+is+required+for+continuous+tumor+growth.">A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth.</a> Cell. 141, 583-594 (2010).</li><li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma.">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li><li>Graham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive,+quiescent,+Philadelphia-positive+stem+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+are+insensitive+to+STI571+in+vitro.">Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro.</a> Blood. 99, 319-325 (2002).</li><li>Holyoake, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+quiescent+leukemic+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+spontaneously+initiate+factor-independent+growth+in+vitro+in+association+with+up-regulation+of+expression+of+interleukin-3.">Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3.</a> Blood. 97, 720-728 (2001).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li><li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution.">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+Human+Glioblastoma+Multiforme+Tumor+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد أظهرت عددا متزايدا من الدراسات على أهمية وجود حجرة الفرعية بطيئة تقسيم الخلايا في سرطان التي تسهم في تشكيل الورم والعلاج المقاومة 2-8. ولذلك فمن الأهمية بمكان لوصف وتوحيد الطرق التجريبية تمكن دراسة هذه حيوانية معينة من الخلايا أو أكثر لمقارنة مجموعات سكاني?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> نوع </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC متوسطة بصل (الإنسان) </td><td> متوسط </td><td> وقف تقنيات الخليوي </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC المكملات انتشار (الإنسان) </td><td> الملحق المتوسطة </td><td> وقف تقنيات الخليوي </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> 0.05٪ التربسين EDTA- </td><td> كاشف </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> فول الصويا التربسين المانع </td><td> كاشف </td><td> سيجما </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> كاشف </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 قارورة </td><td> ثقافة وير </td><td> Nalge نونك الدولية </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 قارورة </td><td> ثقافة وير </td><td> Nalge نونك الدولية </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 مل أنابيب </td><td> ثقافة وير </td><td> BD الصقر </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 مل أنابيب </td><td> ثقافة وير </td><td> BD الصقر </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> عامل النمو </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace انتشار الخليوي CFSE كيت </td><td> الفلورسنت انقسام الخلية تتبع صبغ </td><td> الجزيئية مجسات، إينفيتروجن </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)

عدم التجانس الورم يمثل سمة أساسية دعم متانة الورم ويشكل عائقا أساسيا في وضع استراتيجيات علاجية 1. للتغلب على مسألة عدم التجانس الورم، فمن الضروري لتطوير المقايسات وأدوات تمكينية المظهري، (EPI) تحديد الوراثية والوظيفية وتوصيف المجموعات السكانية الفرعية التي تدفع الأمراض السرطانية مرض محدد، وتمثل الأهداف ذات الصلة سريريا. والآن راسخة أن الأورام تظهر متميزة الفرعية كسور الخلايا مع ترددات مختلفة من انقسام الخلايا، والذي يرتبط بشكل إيجابي على معايير وظيفية يجري الدراجات بطيئة مع القدرة تشكيل الورم في سرطان عدة بما في ذلك الدماغ والجلد والثدي و البنكرياس وكذلك سرطان الدم 2-8. تم استخدام صبغة الفلورسنت carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) لتتبع وتيرة انقسام الخلايا في المختبر والمجراة في الدم المنقولة رumors والأورام الصلبة مثل ورم أرومي دبقي 2،7،8. يتم تحويل الخلايا نفيذ غير الفلورسنت المؤيدة لتعاطي المخدرات من قبل CFSE الاسترات داخل الخلايا إلى مجمع الفلورسنت، والتي يتم الاحتفاظ داخل الخلايا بواسطة ملزمة تساهميا إلى البروتينات من خلال رد فعل شاردة في succinimidyl مع مجموعات أمين الخلايا لتشكيل السندات مستقرة أميد 9. موزعة بالتساوي بين صبغة الفلورسنت الخلايا الوليدة على الانقسامات، مما أدى إلى بمقدار النصف من شدة التألق مع كل انقسام الخلية. وهذا يتيح تتبع دورة الخلية تردد تصل إلى 8-10 جولات من تقسيم 10. وقد استخدم CFSE القدرة على الاحتفاظ بخلايا ورم في المخ لتحديد وعزل جزء من السكان الدراجات بطيئة (أعلى 5٪ صبغ الاحتفاظ الخلايا) أظهرت لتخصيبه في نشاط الخلايا الجذعية السرطانية 2. يصف هذا البروتوكول أسلوب تلطيخ الخلايا مع CFSE وعزل السكان الفردية ضمن ثقافة الإنسان الدبقأرومي (GBM) الخلايا المشتقة امتلاك معدلات مختلفة باستخدام تقسيم التدفق الخلوي 2. وقد خدم هذه التقنية لتحديد وعزل ورم دماغي بطيء الدراجات السكان من الخلايا بحكم قدرتها على الإبقاء على وضع العلامات CFSE.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE at JoVE.com

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

هذا الفيديو يشرح بروتوكول تطبيق صبغة الفلورسنت استر succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) لتحديد وفصل السكان الفرعية المختلفة من الخلايا في ورم أرومي دبقي الإنسان على أساس تواتر انقسام الخلايا.

تحديد وعزل بطيئة تقسيم الخلايا في الإنسان عن طريق ورم أرومي دبقي كربوكسي فلوريسئين Succinimidyl استر (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

14.0K Views.  The University of Florida. هذا الفيديو يشرح بروتوكول تطبيق صبغة الفلورسنت استر succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) لتحديد وفصل السكان الفرعية المختلفة من الخلايا في ورم أرومي دبقي الإنسان على أساس تواتر انقسام الخلايا.

Video: Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

داخل الأنف تسليم الخلايا الجذعية العلاجية إلى الورم الدبقي في نموذج الفأر

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

تحديد خصائص الخلايا المناعية في الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام التدفق الخلوي

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

عزل خلايا Decidual البشرية الأولية من الأغشية الجنينية لمصطلح مترافق

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...