ويتم تمويل بيوفيلم ذات الصلة العمل في المختبر من المنح ومرقمة R21DE017294 R21AI080930 من المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والجمجمة ، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (لJLL - R). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للNIDCR ، NIAID أو في المعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد C. albicans C. albicans هو مجموعة الكائنات الحية الدقيقة 1/BSL1 المخاطر. تذكر دائما أن حسن استخدام تقنيات العقيم / معقمة للعمل مع هذه الكائنات الدقيقة ومتابعة الإجراءات المؤسسية في مجال التخلص السليم من المواد بيولوجية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الثقافة بين عشية وضحاها من C. albicans في المتوسط ​​(الخميرة ببتون سكر العنب) YPD السائل ، فحقن مستعمرة واحدة من C. albicans الى 25 مل من YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة في احتضان شاكر المداري (حوالي 180 دورة في الدقيقة) عند 30 درجة مئوية خلال الليل. معظم جيم سوف albicans سلالات خلايا الخميرة تنمو في ظل هذه الظروف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الثقافات بين عشية وضحاها (حوالي 3000 دورة في الدقيقة ، 5-10 دقائق) ، وغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة ، وresuspend الكرية النهائي في حوالي 20-25 مل من المتوسط ​​1640 RPMI مخزنة مع 165 ملم إلى 7.0 morpholinepropanesulfonic حامض درجة الحموضة وقبل تحسنت - في 37 (ويشار من الآن فصاعدا هذه الوسيلة لأنها &quot;RPMI 1640&quot; ببساطة) درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. بعد الفرز ، وإعداد تعليق من الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائي من 1.0 × 10 6 خلية / مل RPMI في عام 1640. ملاحظة : نظرا لأن الخلايا لديهم ميل إلى تجميع ، فمن المهم أن دوامة بقوة بين الغسيل وقبل pipetting. </li></ol> 2. إعداد اللوحة 96 - جيدا Microtiter لتشكيل بيوفيلم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الأقنية إضافة 100 ميكرولتر من C. albicans تعليق في آبار مختارة من 96 لوحة microtiter جيدا (ليالي). لا تضيف إلى الخلايا في العمود 12 بئرا ، وهذه ستكون بمثابة الضوابط سلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة microtiter كامل مع غطاء الأصلي ، مع ختم parafilm ، مكان داخل الحاضنة واحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. ويمكن تكييف طول حضانة لتصميم التجريبية المحددة. على سبيل المثال ، فمن الممكن لدراسة حركية تشكيل بيوفيلم خلال الفترة من 24 -- 48 ساعة من قبل البذر لوحات متعددة وتجهيز كل لوحة في نقاط زمنية مختلفة (أي 2 ، 4 ، 8 ، 12 ، 24 و 48 ساعة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشكيل بيوفيلم ، وذلك باستخدام ماصة الأقنية نضح المتوسط ​​بعناية حتى لا تلمس وتعطيل الأغشية الحيوية التي شكلت في كل من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحات متعددة ماصة يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة (200 ميكرولتر لكل بئر). بدلا من ذلك ، استخدم لوحة microtiter غسالة آلية. بين يغسل ، وخصوصا بعد غسل الماضي ، واستنزاف لوحات في وضع مقلوب بواسطة النشاف مع المناشف الورقية لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية. في هذه النقطة يجب أن الأغشية الحيوية التي شكلت في الجزء السفلي من الآبار تكون مرئية بوضوح حتى بالعين المجردة ، ويمكن أيضا تصور باستخدام مجهر مقلوب (الشكل 1). الأغشية الحيوية هي الآن على استعداد لمعالجتها للفطريات المقايسات اختبار الحساسية. (إذا كان الغرض الرئيسي من هذه التجربة هو تقييم مدى تشكيل بيوفيلم ، لوحات مستعدون لتتم معالجتها باستخدام الأسلوب اللونية ، ولهذا ، يمكن إضافة كاشف XTT / ميناديون (انظر الخطوة 3 أدناه) ، واللون الناتج قراءة باستخدام قارئ لوحة microtiter). </li></ol> 3. اختبار مضاد للحساسية الأغشية الحيوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الحلول أو مسحوق الأوراق المالية ، وإعداد العاملين في حل المتوسط ​​1640 RPMI كل مضاد لفحصها. تركيزات عالية النموذجية هي 1024 ميكروغرام / مل لفلوكونازول ، و 16 ميكروغرام / مل لالأمفوتريسين B على حد سواء وcaspofungin. ويمكن استخدام تركيزات مختلفة أخرى عن وكلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة متعددة ، إضافة 200 ميكرولتر من ارتفاع تركيز عمل مضاد للآبار المناظرة في العمود 1 من كل لوحة تحتوي على microtiter الأغشية الفطرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 1640 إلى RPMI كل بئر في العمودين 2 إلى 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من RPMI 1640 إلى الآبار في العمود 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 100 ميكرولتر من عامل مضاد للفطريات من الآبار من العمود (1) وإضافة إلى الآبار المجاورة في العمود 2 (يحتوي بالفعل 100 ميكرولتر من المتوسط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج جيد من قبل محتويات pipetting صعودا وهبوطا لإجراء التخفيف مضاعفة المسلسل ، وإزالة النصائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر تحريك لليمين حتى آبار العمود 10 ، وبعد ذلك يتم تجاهل حجم النهائي 100 ميكرولتر من الآبار العمود 10 بعد الاختلاط. في هذا السبيل ، تم إنشاء سلسلة من التخفيفات مضاعفة من وكيلك (ليالي) في المصالح ؛ من معظم الآبار تتركز في العمود 1 إلى الأقل تتركز في العمود 10 من الآبار. والأغشية الحيوية دون منازع في العمود 11 بمثابة الضوابط الإيجابية ، والآبار الفارغة في العمود 12 ستكون بمثابة الضوابط سلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي لوحات ذات الأغطية لهم ، وختم مع parafilm واحتضان لح -48 24 إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة تغسل الصحون كما في الخطوة قبل 2.4 (PBS × 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الأقنية إضافة 100 ميكرولتر من XTT / ميناديون حل لتحتوي كل منها على بئر بيوفيلم قبل غسلها وكذلك آبار المراقبة السلبية لقياس X الخلفيةTT - اللونية المستويات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعدة XTT كحل المشبعة بنسبة 0.5 غرام / لتر في اكتات رينغر العقيمة ، وبرنامج تلفزيوني أو المالحة ، الذي يحتاج الى تعقيم فلتر تصفية باستخدام 0.22 ميكرون ، حجم المسام. الحل هو ضوء XTT الحساسة ، ولذلك يجب تغطيتها بورق الألمنيوم أثناء التحضير. أعدت مرة واحدة وتعقيم فلتر ، قسامة في أحجام 10 مل العمل ، وتخزينها في -70 درجة مئوية. حماية الأنابيب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. ذوبان الجليد فقط على العديد من الأنابيب اللازمة لإجراء تجربة معينة فقط قبل استخدامه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعدة ميناديون كحل ملي الأسهم 10 في الاسيتون 100 ٪ ، إلى أصغر حجم aliquoted (حوالي 50 ميكرولتر) وتخزينها في -70 درجة مئوية. إعداد الحل XTT / ميناديون فقط قبل استخدامه ، وذلك بإضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون من ميناديون لأنبوب تحتوي على 10 مل من محلول XTT المذوبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي لوحات في رقائق الألومنيوم واحتضان في الظلام لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكشف لوحات. باستخدام ماصة الأقنية إزالة 80 ميكرولتر من طاف الملونة الناتجة من كل بئر ونقل في المقابل من الآبار لوحة microtiter جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة لوحة (ليالي) في لوحة microtiter قارئ في 490 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الحد الأدنى لاطئة تركيزات المثبطة SMIC50 وSMIC80 ، والتي هي تجمعات الفطريات التي يتم فيها الكشف عن انخفاض بنسبة 50 ٪ أو 80 ٪ في قراءات في المقارنة اللونية لسيطرة الأغشية الحيوية التي شكلت في غياب الدواء مضاد للفطريات (في هذه الحالة قيم العمود 11 ، وتذكر أيضا أن طرح القيم السلبية من الضوابط من الآبار التي تحتوي على 12 في العمود XTT فقط). ويمكن عرض النتائج SMIC كجدول (عزلة متعددة ضد أي مضادات الفطريات متعددة) أو بدلا من ذلك ، يمكن تقديم النتائج لكل فرد الفطرية عزل ضد بعضها مضاد للفطريات مثل رسم بياني عن طريق تثبيط بالتآمر في المئة مقابل تركيز الفطريات. </li></ol> مثلا : بعد طرح القيم السلبية في السيطرة ، والتطوير التنظيمي متوسط ​​الأغشية الحيوية التي تشكلت في السيطرة العمود 11 هو 1.32. وSMIC50 هو أدنى تركيز الفطريات التي تؤدي إلى الحد من&gt; 50 ٪ في القراءات اللونية ، في هذه الحالة أقل من 1.32 X 50 / 100 = 0.66. وبالمثل ، فإن SMIC80 هو أدنى تركيز الفطريات التي تؤدي إلى الحد من&gt; 80 ٪ في القراءات اللونية ، في هذه الحالة أقل من 1.32 X 0.264 = 20/100. 4. ممثل النتائج الشكل 1 يبين microphotograph لجيم شكلت albicans بيوفيلم على الجزء السفلي من بئر في لوحة 96 microtiter كذلك اتخذت باستخدام مجهر مقلوب. ويبين الشكل 2 - XTT اللونية قراءات (OD 490 القيم) لكل واحد من 11 من الأغشية الحيوية C. albicans نوع السلالة البرية التي تشكلت في كل من الصفوف 8 مختلفة من نفس لوحة 96 microtiter جيدا. الشكل 3 يبين نشاط الأمفوتريسين B بتركيزات مختلفة ضد C. albicans الأغشية الحيوية ؛ تشير الأسهم SMIC50 SMIC80 والقيم. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 (أ) لوحة ويظهر microphotograph التي يتم التقاطها باستخدام كاميرا مثبتة على مجهر مقلوب لجيم albicans بيوفيلم تشكلت على قاع البئر بعد تطلع RPMI المتوسطة وغسيل لاحقة مع برنامج تلفزيوني. (ب) صورة مجهرية لجيم نموذجية تصور albicans بيوفيلم باستخدام المجهر الإلكتروني. الحانات هي 100 ميكرون وميكرون (10) لوحات A و B على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تشكيل جيم يعادل متعددة albicans الأغشية الحيوية في 96 - جيدا لوحات microtiter. اللونية قراءات (OD 490 القيم) من XTT الحد من الأغشية الحيوية المقايسات التي شكلتها C. albicans النوع البري في الآبار لوحات microtiter. القيم هي لمدة 11 الأغشية الحيوية المستقلة التي تشكلت في كل من 8 صفوف مختلفة من نفس لوحة 96 microtiter جيدا. وتمت مقارنة النتائج للصفوف مختلفة في اتجاه واحد ، وتحليل التباين باستخدام اختبار بارتليت للتجانس الفروق والمقارنة وBonferroni المتعددة في مرحلة ما بعد الاختبار. ولم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية عند المقارنة بين كل زوج من الصفوف لبعضها البعض (P&gt; 0.05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. نموذجي نتائج اختبارات الحساسية ضد الفطريات C. albicans الأغشية الحيوية. رسم بياني يصور النتائج النموذجية لفعالية تركيزات مختلفة من الأغشية الحيوية ضد الأمفوتريسين B لجيم albicans نوع السلالة البرية. كما يتم التعبير عن القيم اللونية قراءات في المئة في المتوسط ​​للحد من المقايسات XTT مقارنة للسيطرة على الآبار. ويشار إلى SMIC50 SMIC80 القيم السهام.

<ol>
	<li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms.">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li><li>Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t+etrazolium+hydroxide+(XTT)+colorimetric+method+with+the+standardized+National+Committee+for+Clinical+Laboratory+Standards+method+of+testing+clinical+yeast+isolates+for+susceptibility+to+antifungal+agents.">Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents.</a> J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).</li><li>Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+and+limitations+of+the+XTT+assay+in+studies+of+Candida+growth+and+metabolism.">Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism.</a> J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).</li><li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms:+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins.">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p:+a+regulator+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation.">C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation.</a> Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).</li><li>Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+biofilms:+an+update.">Candida biofilms: an update.</a> Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+combinations+against+Candida+albicans+biofilms+in+vitro.">Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).</li><li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies.">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li><li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts.">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li><li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development,+modeling+a+host-pathogen+interaction.">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li></ol>

JLL - R تملك الأسهم في شركة MicrobeHTS ، التكنولوجيات ، وهو مضاد للفطريات وكلاء النامية. قدمت MicrobeHTS تكنولوجيز ، وشركة أي دعم مالي لهذه الدراسات.

نحن هنا وصف بسيط وسريع والاقتصادية واستنساخه غاية 96 لوحة microtiter نموذج جيد لتشكيل الأغشية الحيوية المبيضات مقرونا اللونية الأسلوب الذي يقيس النشاطات الأيضية من الخلايا داخل بيوفيلم XTT به. وقد تم تطوير هذا الأصل 96 لوحة microtiter كذلك نموذجا لتشكيل بيوفيلم لجيم وي...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sabouraud-dextrose agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211584</td>
<td>To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates</td>
</tr>
<tr>
<td>YPD: Yeast peptone dextrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>US Biological </td>
<td>Y2076</td>
<td>Medium for propagation of overnight liquid cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>50-020-PB</td>
<td>Liquid medium for biofilm formation</td>
</tr>
<tr>
<td>Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP308</td>
<td>To buffer RPMI 1640</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline, PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>Buffer for washes</td>
</tr>
<tr>
<td>XTT sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>X4251</td>
<td>See above for preparation instructions</td>
</tr>
<tr>
<td>Ringer's lactate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>NDC0409-7953-09</td>
<td>For preparation of XTT solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Menadione</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5625</td>
<td>Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml conical centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multichannel pipette and tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtiter plate reader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of candida albicans biofilms

المبيضات البيض يظل السبب الأكثر شيوعا للالتهابات فطرية في زيادة عدد السكان من المرضى للخطر والمبيضات الآن هو الثالث الأكثر شيوعا العدوى في المستشفيات في الولايات المتحدة. وترتبط مظاهر مختلفة من المبيضات مع تشكيل بيوفيلم ، سواء على أنسجة المضيف و / أو الأجهزة الطبية (القسطرة أي). تشكيل بيوفيلم دلالات سلبية السريرية ، ومحمية داخل خلايا الأغشية الحيوية من الاستجابات المناعية والمضيف من عمل مضادات الفطريات. وقد طورنا نموذجا بسيطا وسريعا وقويا في المختبر لتشكيل C. الأغشية الحيوية albicans به جيدا microtiter 96 لوحات ، والتي يمكن أن تستخدم أيضا لاختبار قابلية بيوفيلم مضاد. قراءات من هذا الاختبار هو اللونية ، على أساس الحد من XTT (أ tetrazolium الملح) بواسطة عملية الأيض نشطة بيوفيلم الخلايا الفطرية. تجربة نموذجية تأخذ ما يقرب من 24 ساعة لتشكيل بيوفيلم ، مع 24 ساعة إضافية لاختبار الحساسية المضادة للفطريات. بسبب بساطتها واستخدام المواد المتوفرة عادة المختبرات والمعدات ، وهذه التقنية نظاما ديمقراطيا البحوث بيوفيلم ويمثل خطوة مهمة نحو توحيد اختبار الحساسية من الفطريات الأغشية الفطرية.

Watch this Scientific Journal Video about A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms at JoVE.com

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة وقوية لتشكيل<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; الأغشية الحيوية باستخدام 96 لوحات microtiter جيدا وفائدتها في اختبار قابلية مضاد للخلايا داخل الأغشية الحيوية.

96 ألف لوحة حسنا Microtiter القائم على أسلوب تشكيل لمراقبة واختبار قابلية مضاد المبيضات البيض الأغشية الحيوية

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

a-96-well-microtiter-plate-based-method-for-monitoring-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

44.5K Views.  University of Texas San Antonio - UTSA. نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة وقوية لتشكيل المبيضات البيض الأغشية الحيوية باستخدام 96 لوحات microtiter جيدا وفائدتها في اختبار قابلية مضاد للخلايا داخل الأغشية الحيوية.

Video: A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter تشكيل بيوفيلم الطبق الفحص

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات مجمع المتفطرة السل للأدوية الخط الأول والثاني عن طريق التخفيف في شكل حساء بلايت Microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

مرجع مرق الطريقة Microdilution لDalbavancin<em&gt; في المختبر</em&gt; حساسية اختبار من البكتيريا التي تنمو هوائيا

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

العميق "الجلد حقن كنموذج" "عدوى الجلد" المبيضات البيض "التحليل النسيجي"

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

المعالجة الضوئية اليومية مع الضوء الأحمر لتنظيم "النمو بيوفيلم" المبيضات البيض

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

توضيح والتصوير المبيضات ألبيكانس بيوفيم

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, mouth, vagina, and skin. Despite the availability of antifungal medication, the mortality rate of invasive candidiasis remains ~50%. Unfortunately, the incidence of drug-resistant C. albicans is increasing globally. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) may offer an alternative or adjuvant treatment to inhibit C. albicans biofilm formation and overcome drug resistance. Rose bengal (RB)-mediated aPDT has shown effective cell killing of bacteria and C. albicans. In this study, the efficacy of RB-aPDT on multidrug-resistant C. albicans is described. A homemade green light-emitting diode (LED) light source is designed to align with the center of a well of a 96-well plate. The yeasts were incubated in the wells with different concentrations of RB and illuminated with varying fluences of green light. The killing effects were analyzed by the plate dilution method. With an optimal combination of light and RB, 3-log growth inhibition was achieved. It was concluded that RB-aPDT might potentially inhibit drug-resistant C. albicans.

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

The growing incidence of drug-resistant Candida albicans is a serious health issue worldwide. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) may offer a strategy to fight against drug-resistant fungal infections. The present protocol describes Rose bengal-mediated aPDT efficacy on a multidrug-resistant C. albicans strain in vitro.

روز البنغال العلاج الضوئي الديناميكي بوساطة لمنع المبيضات البيضاء

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...