Biofilme relacionadas ao trabalho no laboratório é financiado por verbas numeradas e R21DE017294 R21AI080930 do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial e do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (para JLL-R.). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIDCR, o NIAID ou o NIH.

1. Preparação de C. albicans C. albicans é um microorganismo 1/BSL1 Risk Group. Lembre-se sempre ao bom uso de técnicas assépticas / estéril para trabalhar com este microorganismo e seguir os procedimentos institucionais para o descarte adequado de materiais de risco biológico. <ol><li> Prepare uma cultura overnight de C. albicans em YPD médio (Yeast peptonada Dextrose) líquido através da inoculação de uma única colônia de C. albicans em 25 mL de YPD. </li><li> Incubar a cultura em um shaker orbital (cerca de 180 rpm) a 30 ° C durante a noite. Mais C. albicans cepas vai crescer como células de levedura sob essas condições. </li><li> Centrifugar as culturas durante a noite (cerca de 3.000 rpm, 5-10 minutos), lave as células duas vezes com PBS estéril, e ressuspender o sedimento final em cerca de 20-25 mL de meio RPMI 1640 tamponado com 165 mM de ácido morpholinepropanesulfonic a 7,0 pH e pré-aquecido a 37 ° C (a partir de agora este meio é referido simplesmente como &quot;RPMI 1640&quot;). </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitômetro. Após a contagem, prepare uma suspensão de células em uma densidade final de 1,0 x 10 6 células / mL em RPMI 1640. Nota: Como as células têm uma tendência a se agregar, é importante vortex vigorosamente entre as lavagens e antes de pipetar. </li></ol> 2. Configurando o de 96 poços da placa de microtitulação para a formação do biofilme <ol><li> Usando uma pipeta multicanal adicionar 100 mL de C. albicans suspensão em poços selecionados dos 96 poços da placa de microtitulação (-s). Não adicione células para poços na coluna 12, como estes servirão como controles negativos. </li><li> Cobrir a placa de microtitulação inteiro com sua tampa original, vedação com parafilme, coloque dentro de uma incubadora e incubar por 24 horas a 37 ° C. A duração da incubação pode ser adaptado para o projeto experimental específico. Por exemplo, é possível examinar a cinética de formação de biofilme ao longo de um período de 24-48 horas de semeadura placas múltiplas e processamento de cada placa em momentos diferentes (ie 2, 4, 8, 12, 24 e 48 h) </li><li> Após a formação de biofilme, usando uma pipeta multicanal aspirar o meio com cuidado de não tocar e interromper os biofilmes que se formaram em cada um dos poços. </li><li> Usando uma pipeta multicanal placas lavar três vezes em PBS estéril (200 mL por poço). Alternativamente, use uma lavadora automática de microtitulação. Entre as lavagens, e particularmente após a última lavagem, escorrer as placas em posição invertida por blotting com toalhas de papel para remover qualquer PBS residual. Neste ponto biofilmes formados no fundo dos poços deve ser claramente visível mesmo a olho nu e também pode ser visualizado através de um microscópio invertido (Figura 1). Biofilmes está agora pronto para ser processada para os testes de testes de susceptibilidade antifúngica. (Se o principal objetivo do experimento é avaliar a extensão da formação de biofilme, as placas estão prontas para serem processadas utilizando o método colorimétrico. Para isso, o reagente XTT / menadiona (consulte a Etapa 3 abaixo) pode ser adicionado ea cor resultante ler usando um leitor de placas de microtitulação). </li></ol> 3. Testes de Susceptibilidade antifúngica de Biofilmes <ol><li> A partir de soluções estoque ou em pó, prepare uma solução de trabalho em meio RPMI 1640 de cada antifúngico a ser testado. Típico altas concentrações são 1.024 mcg / mL para fluconazol, e 16 mcg / mL para ambos anfotericina B e caspofungina. Outras concentrações podem ser usados ​​para diferentes agentes. </li><li> Usando uma pipeta multicanal, adicione 200 mL da alta concentração de trabalho de antifúngicos aos poços correspondentes na coluna 1 de cada placa de microtitulação contendo biofilmes de fungos. </li><li> Adicionar 100 mL de RPMI 1640 em cada poço nas colunas 2 a 10. </li><li> Adicionar 100 mL de RPMI 1640 para poços na coluna 11. </li><li> Remover 100 mL de agente antifúngico dos poços da coluna 1 e adicione aos poços adjacentes na coluna 2 (já contendo 100 mL de meio). </li><li> Misture o conteúdo bem pipetando cima e para baixo para realizar uma diluição de duplicação de série, e retire as pontas. </li><li> Repita se movendo para a direita até os poços da coluna 10, após o qual o volume de 100 mL finais dos poços da coluna 10 após a mistura é descartado. Desta forma, uma série de diluições de seu agente (-s) de interesse foram criados, a partir de mais concentrada em poços da coluna 1 para o menos concentrado em poços da coluna 10. Biofilmes incontestado na coluna 11 servirá como controle positivo, e poços vazios na coluna 12 servirão como controles negativos. </li><li> Cobrir as placas com suas tampas, vedação com parafilme e incubar por 24 -48 h a 37 ° C. </li><li> Após o período de incubação, lavar os pratos como na Etapa 2,4 antes (3 x PBS). </li><li> Usando uma pipeta multicanal adicionar 100 mL de XTT / menadiona solução para cada poço contendo um biofilme pré-lavados, bem como para poços de controlo negativo para a medição de fundo XTT-colorimétrico níveis. <ol><li> O XTT é preparado como uma solução saturada, 0,5 g / L de lactato Ringer estéril, a PBS ou salina, que precisa ser esterilizada por filtração, usando um filtro de 0,22 mM tamanho de poros. A solução XTT é sensível à luz, por isso deve ser coberto com papel alumínio durante a preparação. Depois de preparado e esterilizada por filtração, alíquota, em 10 mL volumes de trabalho, e armazenar a -70 ° C. Proteger os tubos de luz usando uma folha de alumínio. Descongele somente como tubos que forem necessárias para uma experiência especial pouco antes de usar. </li><li> Menadiona é preparado como uma solução estoque 10 mM em acetona 100%, aliquotado em volumes menores (cerca de 50 mL) e armazenados a -70 ° C. Prepare a solução XTT / menadiona pouco antes de usar, adicionando 1 mL da solução estoque de menadiona a um tubo contendo 10 mL da solução XTT descongelado. </li></ol></li><li> Cobrir as placas em papel alumínio e incubar no escuro por 2 h, a 37 ° C. </li><li> Descubra as placas. Usando uma pipeta multicanal remover 80 mL do sobrenadante resultante cor de cada bem e transferir para os poços correspondente de uma nova placa de microtitulação. </li><li> Leia a placa (-s) em um leitor de placas de microtitulação a 490 nm. </li><li> Calcular a concentração inibitória mínima sésseis SMIC50 e SMIC80, que são as concentrações antifúngicas em que uma diminuição de 50% ou 80% em leituras colorimétricas são detectados em comparação com o controle de biofilmes formados na ausência de drogas antifúngicas (neste caso, os valores para a coluna 11 , lembre-se também para subtrair valores de controles negativos de poços na coluna 12 XTT contendo apenas). SMIC resultados podem ser apresentados como uma tabela (ou seja, isola múltiplas contra antifúngicos múltipla) ou, alternativamente, os resultados individuais para cada fúngicas isolar uns contra os antifúngicos pode ser apresentado como um gráfico plotando inibição por cento versus concentração de antifúngico. </li></ol> Exemplo: Depois de subtrair os valores no controle negativo, o OD média de biofilmes controle formado na coluna 11 é 1.32. O SMIC50 é a menor concentração antifúngicos levando a uma redução&gt; 50% em leituras colorimétricas, neste caso, menos de 1,32 x 50/100 = 0,66. Da mesma forma, o SMIC80 é a menor concentração antifúngicos levando a uma redução&gt; 80% em leituras colorimétricas, neste caso, menos de 1,32 x 20/100 = 0,264. 4. Resultados representante A Figura 1 mostra uma microfotografia de um C. albicans biofilme formado no fundo de um poço em uma placa de microtitulação de 96 poços realizadas em microscópio invertido. A Figura 2 mostra XTT-colorimétrico leituras (OD 490 valores) para cada um dos 11 biofilmes de C. albicans cepa selvagem formado em cada uma das 8 linhas diferentes da mesma placa de microtitulação de 96 poços. A Figura 3 mostra a atividade de anfotericina B em diferentes concentrações contra C. albicans biofilmes; setas indicam SMIC50 e SMIC80 valores. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) Painel A mostra uma microfotografia tiradas com uma câmera acoplada a um microscópio invertido de um C. albicans biofilme formado no fundo do poço após a aspiração de meio RPMI e lavagens subsequentes com PBS. (B) A micrografia de um típico C. albicans biofilme visualizados através de microscopia eletrônica de varredura. Barras são 100 mm e 10 mm para os painéis A e B, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Formação de múltiplas equivalente C. albicans biofilmes em placas de 96 poços de microtitulação. leituras colorimétrico (OD 490 valores) de XTT-redução de ensaios de biofilmes formados por um C. albicans tipo selvagem em poços de placas de microtitulação. Os valores são de 11 biofilmes independente formada em cada uma das 8 linhas diferentes da mesma placa de microtitulação de 96 poços. Resultados para as linhas diferentes foram comparados por meio da análise de variância e pelo teste de Bartlett para homogeneidade de variâncias e comparação múltipla de Bonferroni pós-teste. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas quando se comparam todos os pares de linhas entre si (P&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Os resultados típicos dos testes de susceptibilidade antifúngica contra C. albicans biofilmes Gráfico. retratando os resultados típicos da eficácia de diferentes concentrações de anfotericina B contra biofilmes de C. albicans cepa selvagem. Os valores estão expressos em porcentagem média leituras colorimétrico para XTT redução de ensaios em relação ao controle de poços. SMIC50 e SMIC80 valores são indicados por setas.

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	<li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms.">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li><li>Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t+etrazolium+hydroxide+(XTT)+colorimetric+method+with+the+standardized+National+Committee+for+Clinical+Laboratory+Standards+method+of+testing+clinical+yeast+isolates+for+susceptibility+to+antifungal+agents.">Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents.</a> J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).</li><li>Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+and+limitations+of+the+XTT+assay+in+studies+of+Candida+growth+and+metabolism.">Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism.</a> J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).</li><li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms:+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins.">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).</li><li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p:+a+regulator+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation.">C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation.</a> Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).</li><li>Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+biofilms:+an+update.">Candida biofilms: an update.</a> Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+combinations+against+Candida+albicans+biofilms+in+vitro.">Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).</li><li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies.">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li><li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., L&#243;pez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts.">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li><li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilm+development,+modeling+a+host-pathogen+interaction.">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li></ol>

JLL-R possui capital em MicrobeHTS Technologies, Inc., que está desenvolvendo antifúngicos. MicrobeHTS Technologies, Inc. não forneceu apoio financeiro para estes estudos.

Aqui nós descrevemos um método simples, rápido, econômico e altamente reprodutível 96 modelo da placa de microtitulação bem para a formação de biofilmes de Candida juntamente com um método colorimétrico que mede a atividade metabólica de células dentro do biofilme usando XTT. Este modelo de 96 placa de microtitulação bem para a formação de biofilme foi originalmente desenvolvido para C. albicans, mas pode ser usado para outras Candida spp. e facilmente adaptado para outros org...

<table><tbody><tr><td>Sabouraud-dextrose agar</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates</td></tr><tr><td>YPD: Yeast peptone dextrose</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>Medium for propagation of overnight liquid cultures</td></tr><tr><td>RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>Liquid medium for biofilm formation</td></tr><tr><td>Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>To buffer RPMI 1640</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Buffer for washes</td></tr><tr><td>XTT sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>See above for preparation instructions</td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;s lactate</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>For preparation of XTT solution</td></tr><tr><td>Menadione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette and tips</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Any Supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate reader</td><td>Any Supplier</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of candida albicans biofilms

Candida albicans continua a ser a causa mais freqüente de infecções fúngicas em uma população em expansão de pacientes comprometidos e candidíase é agora o terceiro mais comum de infecção nos hospitais dos EUA. Diferentes manifestações da candidíase são associados com a formação de biofilme, tanto em tecidos do hospedeiro e / ou dispositivos médicos (cateteres, por exemplo). Formação de biofilme carrega negativas implicações clínicas, como as células dentro do biofilme estão protegidos das respostas imune do hospedeiro e da ação de antifúngicos. Nós desenvolvemos um modelo simples, rápido e robusto in vitro para a formação de C. biofilmes albicans utilizando 96 poços de microtitulação-pratos, que também pode ser usado para testes de susceptibilidade antifúngica do biofilme. A leitura deste ensaio é colorimétrico, baseado na redução de XTT (um sal de tetrazólio) por células metabolicamente ativas biofilme fúngicas. Um experimento típico dura cerca de 24 h para a formação de biofilme, com 24 h adicionais para testes de susceptibilidade antifúngica. Devido à sua simplicidade e à utilização de materiais de laboratório comumente disponíveis e equipamento, esta técnica democratiza pesquisa biofilme e representa um passo importante para a padronização dos testes de susceptibilidade antifúngica de biofilmes de fungos.

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Nós descrevemos um método simples, rápido e robusto para a formação de<em&gt; Candida albicans</em&gt; Biofilmes usando 96 placas de microtitulação bem e sua utilidade em testes de susceptibilidade antifúngica de células dentro de biofilmes.

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

44.7K visualizações.  University of Texas San Antonio - UTSA. Nós descrevemos um método simples, rápido e robusto para a formação de Candida albicans Biofilmes usando 96 placas de microtitulação bem e sua utilidade em testes de susceptibilidade antifúngica de células dentro de biofilmes.

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Imunologia e Infecção

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Bioengenharia

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation on implanted devices or catheters, which is associated with increased virulence and mortality. Biofilms produced by different Candida species exhibit enhanced resistance against various antifungal drugs. Therefore, there is a need to develop effective immunotherapies or adjunctive treatments against Candida biofilms. While the role of cellular immunity is well established in anti-Candida protection, the role of humoral immunity has been studied less.
It has been hypothesized that inhibition of biofilm formation and maturation is one of the major functions of protective antibodies, and Candida albicans germ tube antibodies (CAGTA) have been shown to suppress in vitro growth and biofilm formation of C. albicans earlier. This paper outlines a detailed protocol for evaluating the role of antibodies on biofilms formed by C. tropicalis. The methodology for this protocol involves C. tropicalis biofilm formation in 96-well microtiter plates, which were then incubated in the presence or absence of antigen-specific antibodies, followed by a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) assay for measuring the metabolic activity of fungal cells in the biofilm.
The specificity was confirmed by using appropriate serum controls, including Sap2-specific antibody-depleted serum. The results demonstrate that antibodies present in the serum of immunized animals can inhibit Candida biofilm maturation in vitro. In summary, this paper provides important insights regarding the potential of antibodies in developing novel immunotherapies and synergistic or adjunctive treatments against biofilms during invasive candidiasis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

A 96-well microtiter plate-based protocol using a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reduction assay is described herein, to study antibodies' effects on biofilms formed by C. tropicalis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo CF adaptável para testes antimicrobianos e análise de dinâmica microbiana

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Candida albicans biofilme Chip (Ca BChip) para seleção de alto rendimento antifúngico

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

Esclarecendo e Imagem Candida albicans Biofilmes

Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis

Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

Desenvolvimento de um modelo de biofilme de colônia polimicrobiana para testar antimicrobianos na fibrose cística

Como caldo em Vitro rastreio: um método fácil e rápido para detectar novos compostos antifúngicos