وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية [K22ES012264 لAJRB] وجمعية السرطان الأمريكية InstitutionalResearch غرانت [ACS - IRG - 00 - 173-04] projectaward التجريبية [لAJRB]. ونشكر أيضا أعضاء في مختبر المطران لقراءة نقدية للمخطوطة والتعليقات على الفيديو وآدم براون على وجه الخصوص ، لمثال على ما لا يجب فعله. نشكر الدكتور دونالد مكوين من Greehey سرطان الأطفال في معهد بحوث على السماح لنا استخدام نطاق له تشريح / كاميرا الفيديو الموضوعة للتصوير الفيديو تشريح. نشكر دارون براون في لشحذ الأدوات كورت وتصليح الأدوات microdissection لدينا.

1. إزالة أنسجة غريبة من خارج العين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 1X PBS في غطاء من صحن 35mm. وينبغي أن تكون على مستوى أقل بقليل من شفة الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط على التوالي ، ونقل العين (ق) من الأنبوب التخزين إلى صحن 35mm. وغرقت العيون في برنامج تلفزيوني لسببين : 1. فإن أنسجة غريبة &quot;تعويم&quot; بعيدا عن العين بحيث يمكنك رؤية وإزالتها بسهولة ، و 2. أثناء تشريح ، فإن الحفاظ على العين بشكل طبيعي شكله الكروي بينما في التعليق ، مما يسمح لك العمل مع هذا الشكل وليس ضدها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام كل من أزواج من ملقط الزاوية (45 درجة و 15 درجة) ، وإزالة الكثير بلطف والعضلات والنسيج الضام وقت ممكن ، وسحب النسيج ضد التيار (أي نحو القرنية). سوف تبقى بعض النسيج الضام. وينبغي بذل الجهود للضغط مقلة العين أقل قدر ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجارتك 15 ° للملقط مقص الربيع. في حين عقد ثابت مع العين ملقط 45 درجة ، واستخدام المقص لقطع الربيع بعيدا المتبقية العضلات والنسيج الضام ، وكذلك على العصب البصري. * نصيحة : استخدم حافة خارج مقص لدفع الأنسجة ضد الحبوب (نحو الفجوة corneo - الصلبة) ثم تقليم. تستمر حتى تمت إزالة جميع أنسجة غريبة من العين. </li></ol> 2. إزالة القرنية والعدسة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع القرنية مواجهة ، استخدم ملقط 45 درجة تصل إلى أضعاف قرصة صغيرة في وسط القرنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص الربيع ، وجعل شق صغير في قاعدة رفرف. ترك من دحرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد وجهة نظر لا يزال بالملقط الخاص ، تضاف إلى أقل شفرة المقص وعمودي على شق واجراء خفض في اتجاه تقسيم corneo - الصلبة. محاولة للحفاظ على النصل السفلي الخاص تحت القزحية حتى يتم قطع كل من القرنية والقزحية. لا قطع كل الطريق إلى تقسيم corneo - الصلبة. إبقاء مقص إدراجها في العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط الخاص 45 درجة ، وتناوب على العين بعناية بحيث المقص الخاص موازية لتقسيم corneo الصلبة ، وجعل قطع صغيرة. استدارة 360 درجة ببطء العين ، مما يجعل من شقوق صغيرة على طول الطريق حول. مرة أخرى ، في محاولة للحفاظ على شفرة أقل من مقص الربيع الخاص تحت القزحية حتى يتم قطع كل من القزحية والقرنية. رفع القزحية والقرنية بعيدا عن بقية العين والتخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إمالة العين على جانبها والضغط برفق في النصف الخلفي من العين ، مما اضطر الى العدسة. تجاهل العدسة. غير مبطنة من الداخل فنجان العين المتبقية العصبية في الشبكية ، والتي ينبغي أن ننظر على نحو سلس وشفاف. </li></ol> 3. ربع فنجان العين الناتجة عن ذلك ، مما أدى إلى 4 -- &quot;petaled&quot; ، مثل هيكل الزهور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي وضع هذه العين التي افتتاح فنجان العين هو عمودي على جسمك. استخدام الملقط الخاص إلى 45 درجة في فنجان العين ثابت والموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد مقص الربيع الخاص أمامك بحيث تكون عمودية على الجسم ، وإدراج شفرة أقل من مقص الربيع الخاصة بك في الحافة العليا من كأس العين مفتوحة. باستخدام الملقط الخاص ° 45 ، محاذاة بعناية كوب العين بحيث يمكن إجراء واحد ، قطع على التوالي من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري. وينبغي أن تكون جميع قطع عمودي على تقسيم corneo الصلبة ، وإلا المحدد ، يجب أن تذهب إلى أقرب رئيس العصب البصري ممكن دون أن يقطع فيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير فنجان العين 180 درجة ، والحفاظ على تعامد مع جسمك. استخدام التقنية في خطوة 3.2 إلى اجراء خفض عمودي الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير فنجان العين وكرر وصف هذه التقنية في جعل 3.2 إلى اثنين آخرين من التخفيضات. ينبغي لجميع التخفيضات الأربعة قد أقرب إلى 90 درجة بعيدا ممكن. نضع في اعتبارنا أن العين ليست كروية تماما لذلك سيكون هناك بعض التباين. </li></ol> 4. قطع كل من &quot;بتلات&quot; الأربع في النصف ، مما أسفر عن بنية تشبه زهرة ثمانية البتلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل فنجان العين إيواء من الطبق 35mm إلى شريحة نظيفة. مع فنجان العين مواجهة ، مغرفة تحته مع ملقط 45 درجة. رفع بعناية للخروج من السائل ووضعها على شريحة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام كل من أزواج من ملقط الزاوية ، افتح برفق خارج العين ، وشبكية العين مع مواجهة العصبية. لا تقم بإزالة الشبكية العصبي ، فهو يساعد في الحفاظ على العين بعض من شكله الكروي حتى انك لا يعمل ضدها. لأنه يحمي أيضا من التلف RPE بالصدفه في الإجراءات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير الشريحة حتى واحدة من بتلات هو عمودي على جسمك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الملقط الخاص ° 15 ، والاستيلاء على بلطف زاوية البتلة. ينبغي زاوية البتلة تكون القرنية ، وليس الشبكية أو العصبية RPE. ترفع في الزاوية بلطف ، والسماح لها بالاحتفاظ بها انحناء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج شفرة أسفل المقص الخاص الربيع بين البتلة وحرك. يصطف المقص الخاص بحيث يمكن إجراء ، مستقيم واحد ، وقطع عمودي من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري. قطع أقرب إلى رأس العصب البصري ممكن دون أن يقطع فيه. أتركوبتلة ، والسماح لها على الاستلقاء على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير شريحة 90 درجة ، بحيث البتلة المقبل هو عمودي على جسمك. كرر الخطوة 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4.5 و 4.6 ضعف أكثر. ينبغي أن يكون هيكل الناتج تبدو وكأنها زهرة ثمانية البتلة. </li></ol> 5. إزالة العصبية في الشبكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100-200 ميكرولتر من 1X PBS على العينة. وهذا سيمنع الشبكية العصبية من الالتصاق كما كنت قشر تشغيله من RPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة ما يتم إرفاق فضفاضة العصبية في الشبكية إلى RPE. ومع ذلك ، فإنه لا يأخذ الممارسة ، والمهارة الوحيدة لإزالة العصبية في الشبكية وليس RPE. فهم بلطف بتلة من العصبية في الشبكية مع زوج واحد من ملقط الزاوية حين استقرار (باستمرار) بقية العين مع الزوج الآخر من الزاوية ملقط. سحب العصبية في الشبكية بعيدا عن بقية العين. يستمر هذا الإجراء حتى تم إزالة كامل الشبكية العصبية. * تلميح : عصا غيض من الملقط 15 ° الخاص في رأس العصب البصري إلى مرساة العين. ثم استخدم ملقط 45 درجة على كنس الشوارع تحت الشبكية العصبية ورفع وتشغيله بعيدا. فمن الأفضل عادة لرفع الشبكية العصبية من رأس العصب البصري نحو الفجوة corneo - الصلبة. يجب التأكد من الانسحاب من أي مخلفات فضفاض من القزحية. القزحية هي لزجة جدا ويمكن أن تتعثر وإلا لRPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العينة مع 1X PBS. ماصة 100-200 ميكرولتر من 1X PBS في العينة وتمتص منه مرة أخرى. تجاهل برنامج تلفزيوني. كرر حسب الضرورة لإزالة الغبار والحطام. </li></ol> 6. جبل لك عينة (ق) على شريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 80-90 ميكرولتر من الجلسرين 90 ٪ على شريحة جديدة في شكل مستطيل. استخدام الجانب من طرف ماصة لجعل حتى مسحة مستطيلة من الجلسرين. (هذا هو الإجراء لتركيب two RPE على شريحة واحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج أقل من 15 ذراع ملقط ° تحت العينة. رفع بلطف العينة خارج الشريحة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض ببطء العينة إلى الجلسرين. تذبذب بلطف ملقط كما كنت اخراجهم من تحت العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 6،1-6،3 لعينة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير الشرائح بحيث الجانب الطويل هو عمودي على جسمك. عقد الزجاج الخاص تغطية على زاوية 45 درجة إلى الشريحة بحيث أنه لمس الشريحة. تحريكه باتجاه تشويه الجلسرين حتى اللمس. الحفاظ على الاتصال بين الزجاج وتغطي الشريحة ، تتحرك ببطء زجاج الغطاء بعيدا عن التشويه ، باتجاه حافة الشريحة. يصطف الجانبين طويلة من الشريحة وزجاج الغطاء بحيث تكون متوازية. عقد أركان الزجاج غطاء بين الإبهام والسبابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط ملقط ° 15 في يدك الأخرى. مهد العليا (مجانا) حافة الزجاج في تغطية المحتال من ذراعه. ببطء شديد ، وانخفاض الغطاء الزجاجي. عندما يتم الاتصال بين زجاج الغطاء والجلسرين ، والتوقف والانتظار لالجلسرين للهجرة. كرر هذا خفض والانتظار حتى يتم تغطية كاملة يتصاعد RPE كله. هذا هو لمنع الجلسرين عالية اللزوجة من التقاط فقاعات الهواء. لا تضغط باستمرار على ساترة -- الجلسرين والضغط من تحت ، مما يجعل الالتصاق سيئة للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع طلاء الأظافر واضحة ، والطلاء حول محيط حيث يغطي الزجاج وتلبية الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشريحة على قمة الرف فارغة لتجف. </li></ol> 7. ممثل النتائج : وينبغي أن تكون نتيجة هذا الإجراء أن يكون الهيكل الذي يشبه الزهرة ، وينبغي أن تكون متماثلة إلى حد ما. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. وينبغي تحميل كامل من RPE ماوس C67Bl/6J wildtype. RPE من الأسود أو الحيوانات آغوطي تكون مظلمة في اللون البني ويجب أن يكون السطح على نحو سلس. فمن الطبيعي أن نلاحظ التموجات في الطوبوغرافيا من بتلات. قد تصبغ على أية عينة إعطاء تكون متغيرة بعض الشيء ، نظرا لكثافة المتغير تصبغ RPE على حد سواء والمشيمية الكامنة. الأسهم البيضاء تشير الى &quot;قنوات&quot; ناقصة الصباغ -- وهذا أمر طبيعي ويعود إلى الأوعية الدموية الكامنة وراء العين. السهم الأزرق يشير إلى أن الأضرار المادية على حد سواء RPE والمشيمية الكامنة. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. كله من جبل RPE ماوس المخففة. العينات يمكن حصادها من الحيوانات تتراوح في تخفيف لون شفاف تقريبا من الاتحاد الافريقي مقهى قهوة بحليب وأية عينة واحد هو أن يكون التباين في داخله ، وأشار في الدوائر السوداء هنا. بصفة عامة ، RPE تحصد من الحيوانات الأصغر سنا هي أخف وتلك التي تحصد من أقدم الحيوانات أغمق. السهام السوداء تشير بعض الأوعية الدموية الكامنة ، والتي تظهر ناقصة الصباغ. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. يمكن استخدامها للكشف عن تلطيخ Phalloidin أضرارا مادية RPE. Phalloidin تلطيخ يحدد بوضوح الخليةالأغشية ، وتظهر على شكل سداسي من الظهارة. (أ) مثال من الماوس السوداء. (ب) مثال من الماوس المخففة. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. A RPE تشريح سيئة من تمييع ماوس (أ) بين قوسين تشير إلى أن هامش القرنية واسعة جدا ، والذي يمكن أن يسبب التواء و / أو قابلة للطي. داخل دائرة سوداء يمكنك رؤية كميات كبيرة من الأنسجة الغريبة التي لم يتم إزالتها من الجزء الخلفي من العين. فهي واضحة ولا سيما لأن العينة من حيوان المخففة. غير مطوية جزئيا بتلة على اليسار أسفل أكثر. (ب) وهذا كله قد يشن مظهر الدولاب على الهواء. السهام السوداء تشير بعض التخفيضات التي تم إجراؤها. العديد من التخفيضات من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري لا يتماشى مع القطر. (C) السهام السوداء تبين كيف كان ينبغي أن التخفيضات التي أجريت ، وذلك تمشيا مع قطر وعمودي على المماس.

<ol>
	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وRPE هو موقع للامم المتحدة مقايسة ع ، وهي مقايسة في الجسم الحي للإصلاح ، تناظر الموجهة. وقد استخدمت الأمم المتحدة للمقايسة p لدراسة آثار أضرار الحمض النووي DNA ومختلف 1،2 يشير الضرر وإصلاح الجينات 3،4،5 على وتيرة الإصلاح ، ت?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) وتقع في الجزء الخلفي من العين الثدييات ، فقط تحت الشبكية العصبية ، والتي تحتوي على المستقبلات الضوئية (قضبان ومخاريط). وRPE هو أحادي الطبقة من الخلايا الصباغية مكعبية وبشكل وثيق مع شركاء العصبية في الشبكية فقط فوقه. هذا الارتباط يجعل من RPE اهتماما كبيرا للباحثين الذين يدرسون أمراض الشبكية. وRPE هو أيضا موقع لفحص في الجسم الحي من التماثل الموجه إصلاح الحمض النووي ، ومقايسة للأمم المتحدة ع. العين الماوس صعبة للغاية لتشريح بسبب حجمها الصغير (حوالي 3.5mm في القطر) وشكلها كروي. هذه المقالة يوضح بالتفصيل عن إجراء تشريح للعين مما يؤدي إلى تحميل كامل RPE. في هذا الإجراء ، وتبين لنا كيفية العمل معها ، وليس ضد ، والهيكل الكروي للعين. باختصار ، تتم إزالة النسيج الضام والعضلات ، والعصب البصري من الجزء الخلفي من العين. ثم ، يتم إزالة القرنية والعدسة. المقبل ، يتم إجراء تخفيضات الاستراتيجية التي تؤدي إلى تسطيح كبير من الأنسجة المتبقية. أخيرا ، رفع بلطف العصبية في الشبكية الخروج ، كشفت عن RPE سليمة ، والتي لا تزال تعلق على المشيمية الكامنة والصلبة. ويمكن استخدام هذا كله جبل لتنفيذ مقايسة للامم المتحدة لتقييم p أو المناعية أو مناعي من النسيج RPE.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

مظاهرة رسمية للتشريح العين الماوس ، مما أدى إلى تحميل كامل من الظهارة الصبغية الشبكية.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K Views.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. مظاهرة رسمية للتشريح العين الماوس ، مما أدى إلى تحميل كامل من الظهارة الصبغية الشبكية.

Video: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

كله من جبل إعداد الكبار ذبابة الفاكهة الحبل الاعصاب الاماميه للحقن صبغ الألياف العملاق

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

الحوفي-النهج تحت الشبكية حقن الفيروسية المتجهات للعلاج الجيني في الفئران الشبكية الظهارة الصبغية

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

عزل شبكية الفأر وعلاج الميثانول لدراسة خلايا العقدة الشبكية

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

تسليط الضوء على المؤلف: إعداد كامل التركيب قائم على الميثانول للتحقيق في خلايا العقدة الشبكية  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...