وأيد المشروع وصفها من حيث عدد المنح R01HD050725 من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية إلى العلامة المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية أو المعاهد الوطنية للصحة. نشكر أعضاء المختبر Godenschwege فضلا Schreader باربرا لمساهمتها في مخطوطة والفيديو.

1. تشريح الأعصاب من الحبل البطني يمكن إجراء تشريح وصبغ لملء GF في درجة حرارة الغرفة. تشريح لجميع الخطوات الباردة (4 درجات مئوية) وينبغي استخدام المياه المالحة لإبطاء عملية التمثيل الغذائي والحفاظ على الخلايا العصبية على قيد الحياة لفترة أطول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب الكبار (4 أيام أو أكثر) مع CO 2 أو البرد منهم على الجليد حتى يجمد فيها. والتخدير مع الثلج تتطلب المزيد من الوقت (حتى 30 دقيقة) ، ولكن سوف تبقي الذباب يجمد لمدة أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد يطير في طبق بتري Sylgard المغلفة. تشريح هذا يتطلب استخدام التكبير عالية (80 100X) stereomicroscope تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vannas مع مقص ، وإزالة الساقين ، خرطوم ، والأجنحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط الخشنة ودبابيس الحشرات الجميلة (دبابيس minutien) لتوجيه الجانب الظهري حتى ذبابة في صحن Sylgard. دبوس البطن أولا ثم استطال قليلا الحيوان من خلال وضع اثنين من المسامير على كل جانب من الرقبة وخلف الرأس ، بحيث امتدت قليلا الرقبة ويمكن الوصول إليها (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغرق الذبابة في العذبة ، والمياه المالحة الباردة ذبابة الفاكهة. الأكثر استخداما ملاحات ذبابة الفاكهة تكفي لتشريح ، ولكن نحن هنا استخدام المياه المالحة وصفها في قو O&#39;Dowd ، 2006 4. وسوف فقاعة الهواء تحيط الطيران. إزالة الهواء مع حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل قصيرة ، شق الوحشي في نهاية الظهرية من البطن. بدءا من شق ، وجعل الضحلة ، وقطع على التوالي على طول خط الوسط الظهرية من البطن في اتجاه الصدر. ثم يستمر في الضحلة ، وقطع طولية في الصدر ممكن بالتحديد على طول خط الوسط باتجاه الضام. فمن الأهمية بمكان لجعل التخفيضات الضحلة حتى لا تلحق الضرر VNC (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اثنين من دبابيس الحشرات الجميلة بعناية لفتح القفص الصدري. تنتشر في الجسم بعيدا نصفين باستخدام المسامير ووضع العلامات من خلال عضلات الطيران (الشكل 2). يجب أن لا يتم فتح القفص الصدري وكذلك صورت في الشكل 2 لتجنب تمزيق للبشرة. وينبغي لضمان التوجه مباشرة من فنك توضع المسامير في نفس الموقف الأمامي الخلفي في كل جانب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون عرقلت الوصول إلى VNC للحقن صبغة والتصوير المناسبة من جانب الأجهزة الداخلية. ولذلك ، استخدم ملقط ومقص لإزالة المعدة والأمعاء والقلب والأعضاء التناسلية. سحب الغدد اللعابية ملقاة على جانبي VNC. شطف تشريح بعناية مع المالحة جديدة لإزالة الأنسجة والدهون عائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدهون في الجسم من تحت الضام عنق الرحم (سي). والدهون في الجسم مرئيا أفضل في التكبير عالية. استخدام ملقط غرامة على فهم دقيق لأنسجة من الجانب وتخلعها. </li></ol> يمكن إجراء تشريح في غضون 5 إلى 10 دقائق. باستخدام العذبة ، والمياه المالحة الباردة سوف ، غير التالفة تشريح الجهاز العصبي لا تزال على قيد الحياة لمدة ساعة على الأقل. 2. GF ملء الخلايا فمن المستحسن لتنفيذ صبغ ملء في أقرب وقت ممكن بعد تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق Sylgard مع الذبابة تشريح تحت المجهر تستقيم مع مرحلة ثابتة (الشكل 3) وهدف الهواء 10X. مركز العينة مع نهاية الخلفي للتحرك نحو وضع صاحب القطب fill صباغة. على النقيض من استخدام التدخل التفاضلية (DIC) واسطة ، والتركيز على سي. يجب على المحاور الكبرى في GFS تكون مرئية بوضوح على السطح الظهري للسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع وسيفر الصفراء الملح dilithium CH في H2O منزوع الأيونات إلى تركيز 1 ٪. سحب كهربائي زجاج البورسليكات مع خيوط لمقاومة تقريبا. 60-80 MΩ. ينبغي غيض من الزجاج الكهربائي تكون طويلة وحادة. ملء غيض من القطب مع الحل 1 ٪ لوسيفر الأصفر عن طريق وضع القطب المعاكس مع نهاية غيض الكهربائي في الحل صفراء لوسيفر تقريبا. 30-60 ثانية. ثم الردم القطب مع LiCl 3M باستخدام حقنة هاميلتون ترك فقاعة الهواء بين الصبغة وLiCl. ربط كهربائي صبغة التعبئة لمرحلة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود كلوريد الفضة المطلية السلك الكهربائي في الأرض المالحة ومكان القطب صبغ fill فوق موازية يطير الى VNC باستخدام micromanipulator 3D الهيدروليكية. يجب أن تكون متصلا القطب صبغ ملء الى مكبر للصوت يسمح تمرير الحالية من أجل إطلاق سراح سلبا أو إيجابا الأصباغ المكلفة من القطب عن طريق تمرير المفرط أو depolarizing الحالية ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى العدسة مياه الغمر 40X وانخفاض غيض من القطب ملء صباغة على واحدة من GFS. وضع المحاور GF قريبة من السطح الظهري للسي. استخدام الأمام (نحو الرأس) لادخال حركة القطب في GF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغير مصدر الضوء إلى الضوء epifluorescent والتبديل لتصفية صفراء لوسيفر. تطبيق تيار كهربائي hyperpolarizing لتعبئة صبغ مع مكبر للصوت لحقن صفراء لوسيفر في GF. يمكن التحكم بكمية حقن الصبغة التي ال(ه) من تمرير المبلغ الحالي وكذلك المدة يتم تمرير التيار. لمنع صبغة من سفك للخروج من موقع الحقن أو تلف GF ، ينصح باستخدام حقن الحالية المنخفضة (حوالي 3-5 غ) على مدى 1-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الحالية حتى يمكن رؤية المحطة GF VNC بوضوح في الشكل (4A). عبر عن تلطيخ متشابك من الخلايا العصبية بعد المشبكي ، ومواصلة لتمرير الحالية حتى يوم ويمكن أيضا أن ينظر في صبغ الخلايا العصبية بعد المشبكي. إيقاف التيار الكهربائي وإزالة الصبغة التعبئة. </li></ol> 3. ممثل النتائج : ويرد ممثل ملء صبغة واحدة مع GF صفراء لوسيفر في الشكل 4A. وقد حصلت على صورة بوصفها مكدس الصورة في عناصر البرنامج باستخدام كاميرا نيكون البقعة التي شنت على المجهر. في هذا التيار من خلال عينة صدر القطب لحوالي 2 دقيقة. يتم تعبئة شاملة للGF ويسمى كذلك محطة GF كبيرة في الصدر (الشكل 4A ، والقطع الناقص). أي الخلايا العصبية بعد المشبكي مرئية في هذه الحالة ، على الرغم من أن لوسيفر صفراء صغيرة بما يكفي لتمرير من خلال تقاطعات الفجوة. قد لا يتم إذا لم يتم حقن الصبغة طويلة بما فيه الكفاية في GF ثم يملأ عبر متشابك من الخلايا العصبية بعد المشبكي المشاهدة لأن إشارة ضعيفة جدا بحيث لا يمكن الكشف عنها. يمكن أن الخلايا العصبية بعد المشبكي للجزء (الشكل 4B ، ورؤساء السهم) تصور أكثر موثوق به استشفاف حتى أصغر الخلايا العصبية ، مثل Neurobiotin. حقن Neurobiotin 7 ٪ في 2 م حل أسيتات البوتاسيوم مع depolarizing الحالي لمدة 2 دقيقة كافية لتسمية الخلايا العصبية بعد المشبكي بقوة. ويمكن تصور أن يكون لNeurobiotin المجهري باستخدام مبائر Streptavidin بالإضافة إلى الأصباغ من موجات مختلفة. لأن Neurobiotin ليس صبغة الفلورسنت ، وشارك في حقن Rhodamin - ديكستران أو hydrazides اليكسا في نفس الحل ، يمكن استخدام الحقن لمراقبة الناجح في GF (الشكل 4C ، من Boerner وGodenschwege ، 2010 5). <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الرسم التخطيطي لذبابة النظر أفقيا. يتم عرض الصدر مع شق طولي لتصور الهياكل الداخلية. أثناء تشريح ، تم قطع العضلات الظهرية الرحلة طولية (DLMs ، أزرق) دون الإضرار الحبل البطني العصب (VNC ، عميق الحمراء) ، التي تقع الى العضلات البطنية الرحلة. القناة الهضمية (الخضراء) وتقع فوق VNC. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. رأي الظهرية من ذبابة تشريح. يتم وضع اثنين من المسامير وراء الرأس لموقف الطيران. دبابيس مثبتة من خلال عضلات الطيران (DLM) الاستمرار على فتح القفص الصدري. تم إزالة الأعضاء الداخلية لكشف الحبل البطني العصب (VNC). <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. صبغ الإعداد التعبئة. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4 ألف) Z - الإسقاط في الجزء الخلفي من فنك تعرض أحد GF صفراء مليئة وسيفر. وقد حصلت على صورة مباشرة بعد صبغ ملء مع كاميرا الفور. في الحيوانات البرية من نوع الجهاز الطرفي (بيضاوي) في القفص الصدري واضحة للعيان. ب) صورة متحد البؤر صبغة GF تمتلئ Neurobiotin في ذبابة من النوع البري. وصفت كل من جزء (سهام) والخلايا العصبية بعد المشبكي للجزء (رؤساء السهم). وكان تصور Neurobiotin مع Streptavidin بالإضافة إلى Cy3. C) صورة مليئة متحد البؤر البرية من نوع GFS مع Alexa555.

<ol>
	<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Boerner, J., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Average+shape+standard+atlas+for+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord.">Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+synaptic+transmission+in+adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+sity.">Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity.</a> J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).</li><li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+for+the+Drosophila+ventral+nerve+cord+standard+in+neuronal+circuit+reconstruction+and+in-depth+analysis+of+mutant+morphology.">Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology.</a> J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).</li><li>Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conderved+role+for+Drosophila+Neuroglian+and+human+L1-CAM+in+central-synapse+formation.">A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation.</a> Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).</li><li>Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+distinct+from+highwire+for+the+Drosophila+ubiquitin+conjugase+bendless+in+synaptic+growth+and+maturation.">A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation.</a> J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).</li><li>Storkebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+mutations+in+the+tyrosyl-tRNA+synthetase+gene+recapitulate+in+Drosophila+features+of+human+Charcot-Marie-Tooth+neuropathy.">Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+(GFS).">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يمكن تشريح الجهاز العصبي دون استخراج من الجسم يطير. هذا وقد اثنين من المزايا : أولا ، يسبب ضررا قليلا تشريح الجهاز العصبي ، والثانية ، ومعظم الأعصاب البقاء تعلق على العضلات والحواس. أداء التشريح ، كما هو موضح ، ويعد نموذج لوضع العلامات على التوالي إلى الأمام من صبغ GFS. ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> Sylgard سيليكون إلاستومر 184 كيت </td><td> داو كورننغ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تشريح مجهر </td><td> AmScope </td><td> SM - 2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Vannas مقص فائق </td><td> أكاديمية موسيقية </td><td> VS1023 </td><td></td></tr><tr><td> دومون الملقط Dumontstar 55 </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> دبابيس أوسترليتز الحشرات </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 26002-10 </td><td> Ø 0.1mm </td></tr><tr><td> أقطاب البورسليكات الزجاج </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> 1B100F - 4 </td><td></td></tr><tr><td> العمودي الماصة بولير 700c </td><td> ديفيد Kopf الآلات </td><td> نموذج 700C </td><td></td></tr><tr><td> وسيفر صفراء CH dilithium الملح </td><td> سيغما </td><td> L0259 </td><td> 1 ٪ في H 2 O </td></tr><tr><td> ثابت مجهر المرحلة منتصبة والكاميرا </td><td> نيكون </td><td> FN - 1 وكاميرا DS - U2 </td><td></td></tr><tr><td> خطة فلور 10X الهدف الجوية </td><td> نيكون </td><td> CFI خطة فلور 10X NA 0.3 WD 16mm </td><td></td></tr><tr><td> ثر المياه 40X غمس الهدف </td><td> نيكون </td><td> CFI فلور 40X W NA 0.80 WD 2.0mm </td><td></td></tr><tr><td> الهيدروليكية Micromanipulator 3D </td><td> Narishige الدولية </td><td> نموذج MW0 - 3 </td><td></td></tr><tr><td> مكبر الصوت </td><td> الحصول على الآلات ، وشركة </td><td> نموذج 5A </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount preparation of the adult drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection

لتحليل مورفولوجيا محواري وشجيري الخلايا العصبية ، فمن الضروري الحصول على العلامات الدقيقة الهياكل العصبية. تحضير عينات المسمى جيدا مع قليل من دون تلف الأنسجة تمكننا من تحليل الخلايا والتشكل لمقارنة العينات الفردية لبعضهم البعض ، مما يسمح بالتالي تحديد الحالات الشاذة متحولة. في أسلوب أظهر تشريح الجهاز العصبي لا يزال معظمهم داخل يطير الكبار. من خلال شق ظهري ، يتم فتح البطن والصدر ويتم إزالة معظم الأعضاء الداخلية. ويتعرض فقط الجانب الظهري للحبل العصب البطنية (VNC) وسرطان عنق الرحم الضامة (سي) التي تحتوي على محاور عصبية كبيرة من الألياف العملاقة (GFS) 1 ، في حين أن المخ يحتوي على خلايا الجسم والتشعبات GF يبقى 2 في الرأس سليما . وينبغي في هذا التحضير لا تزال تعلق معظم أعصاب VNC لعضلاتهم. بعد التشريح ، ويتجلى ملء الخلايا من الألياف العملاقة (GF) مع صبغة الفلورسنت. في سي تقع المحاوير GF على السطح الظهري ، وبالتالي يمكن تصور بسهولة تحت المجهر مع النقيض تدخل الفرق (DIC) البصريات. هذا يسمح للحقن المحاوير GF مع صبغة في هذا الموقع لتسمية GF بأكملها بما في ذلك المحاور والمحطات الخاصة في فنك. هذا الأسلوب يؤدي إلى تلطيخ موثوقة وقوية من GFS السماح تصوير الخلايا العصبية على الفور بعد ملء مع epifluorescent المجهر. بدلا من ذلك ، يمكن تعزيز إشارة الفلورسنت القياسية المناعية باستخدام الإجراءات المناسبة للفحص المجهري 3 ارتفاع القرار مبائر.

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection at JoVE.com

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تشريح الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</emويتجلى&gt; الحبل البطني العصب (VNC). هذا الأسلوب تشريح خاص يسبب ضررا قليلا إلى VNC يسمح بوضع العلامات اللاحقة من الخلايا العصبية العملاقة الألياف مع صبغة الفلورسنت لتصوير عالية الدقة.

كله من جبل إعداد الكبار ذبابة الفاكهة الحبل الاعصاب الاماميه للحقن صبغ الألياف العملاق

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

whole-mount-preparation-adult-drosophila-ventral-nerve-cord-for-giant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

18.9K Views.  Florida Atlantic University. و في الجسم الحي تشريح الكبار ذبابة الفاكهة الحبل البطني العصب (VNC). هذا الأسلوب تشريح خاص يسبب ضررا قليلا إلى VNC يسمح بوضع العلامات اللاحقة من الخلايا العصبية العملاقة الألياف مع صبغة الفلورسنت لتصوير عالية الدقة.

Video: Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

تسجيلات الكهربية من الألياف المسار عملاق د. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

تقرن Nanoinjection والفحص الكهربية للكشف عن النشاط الحيوي للمركبات باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن نظام الألياف العملاق

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

الجاذبة - DRG وصفها من الخلايا العصبية لدراسة المحاور المتفرعة في إعداد جبل الجامعة الحبل الشوكي الفأر الجنينية

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; ماوس الكبار إعداد العضلات العصبية لدراسة خصائص اطلاق Afferents العضلات

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

لإعداد المائل الحبل الشوكي شرائح لبطني الجذر تحفيز

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...