وكانت الدراسات التي ترعاها AdvanDx.

1. جمع العينات وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدم الوريدي من المرضى الذين يشتبه في الإنتان ووضعها موضع اثنين (سباركس دينار بحريني ، MD) BACTEC زجاجات ثقافة الدم واحد واحد الهوائية اللاهوائية ، التي تشكل معا مجموعة واحدة ثقافة الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان زجاجات من صك BACTEC 9240 بنحو 35 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حتى يتم تشغيل أداة التنبيه الى نتيجة لنمو الكائنات الحية في الدم زجاجة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة زجاجة من الدم صك الثقافة. </li></ol> 2. إعداد الكواشف قبل يلطخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل غسل بإضافة 4 مل من محلول الغسيل 60x تليها 240 مل من المياه العذبة أو منزوع الأيونات المقطر مباشرة إلى الصحن تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق في تلطيخ 55 درجة مئوية إلى حمام ماء دافئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين التركيز على ما تبقى 2-8 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متوسطة متزايدة من الثلاجة والحارة إلى درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 3. تلطيخ غرام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بلطف زجاجة ثقافة الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإبر والمحاقن أو جهاز subculturing ، إزالة الدم (حوالي 5 مل) من الزجاجة وضعها في أنبوب توج برغي معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة معقمة ، ضع نقطة واحدة كبيرة من الدم على شريحة ميكروسكوب زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف الشريحة والإصلاح في الميثانول لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتيح الشريحة في الهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ غرام وصمة عار على الفيلم الدم لتحديد مورفولوجية الكائن نموا في الدم زجاجة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عدسة الغمر النفط ، عرض الشرائح. مكورات إيجابية الجرام في أزواج وسلاسل قصيرة لوحظ على وصمة عار الغرام هو الأكثر اتساقا مع الأنواع معوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه النتيجة محركات غرام وصمة عار ثم اختيار المجموعة المناسبة التحقيق FISH السلطة الوطنية الفلسطينية لاستخدامها لتحديد البكتيريا. وسوف يلطخ هذه الثقافة الدم باستخدام E. البرازية / عمر الفاروق FISH السلطة الوطنية الفلسطينية وصمة عار. </li></ol> 4. السلطة الوطنية الفلسطينية FISH اللطخة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الأنبوب الذي يحتوي على الدم بلطف يحوم قبل إعداد تشهير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد قطرة من محلول التثبيت على البئر لمجهر السلطة الوطنية الفلسطينية الشرائح السمكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10 ميكرولتر أو قطرة واحدة صغيرة من الأنبوب مع ثقافة الدم إيجابية في الحل التثبيت وتخلط برفق لاستحلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح مسحات منهم عن طريق التسخين لمدة 20 دقيقة. عند درجة حرارة 55 مئوية على صفيحة التسخين. </li></ol> 5. مراقبة جودة المواد يجب أن يتم اختبار أحدهما إيجابي والآخر سلبي الشريحة مراقبة الجودة مع كل دفعة من الشرائح لتلطيخ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام E. البرازية / عمر الفاروق التحكم الشرائح التي تم شراؤها من AdvanDx لهذا الغرض أو تحضير مسحات من ثقافات السائل من سلالات مرجعية E. البرازية وهاء faecium والتحكم إما ايجابي على شرائح منفصلة أو مختلطة على شريحة واحدة ، والمكورات العقدية SPP SPP أو كمادة للمراقبة السلبية. </li></ol> وينبغي أن نتائج مراقبة الجودة تكون قادرة على رصد لظروف الاختبارات المناسبة ، وخصوصا تلك التي تؤثر على التقشف وتهجين الخلية اختراق الجدار ، حيث تم تصميم منهجية السلطة الوطنية الفلسطينية لتحسين اختراق جدار الخلية 6. تهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة واحدة من E. البرازية / عمر الفاروق السلطة الوطنية الفلسطينية إلى البئر على الشريحة المجهر مع مسحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ساترة. تجنب فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 ± 5 دقائق. في 55 ± 1 درجة مئوية على لوحة التدفئة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التالية مكان الحضانة الشرائح في شريحة الناقل </li></ol> 7. اغسل صرامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الناقل شريحة في محلول غسل محمى على حرارة 55 درجة مئوية وإزالة بعناية ساترة. في كثير من الأحيان ، وساترة الشرائح قبالة عن طريق اثارة بلطف الشريحة في محلول الغسيل. أحيانا ، يجب أن تكون ساترة دفعت بلطف مع ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حل يغسل لمدة 30 ± 5 دقائق. في 55 ± 1 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من الحل غسل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتيح الشريحة الهواء الجاف </li></ol> 8. متزايد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة واحدة من متوسطة إلى تركيب كل شريحة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ساترة. تجنب فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة الشريحة على المجهر مضان في حدود 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تعرض الشرائح لضوء الشمس المباشر أو غيرها من مصادر الضوء القوي لأن هذا قد يؤدي إلى تبريد مضان. </li></ol> 9. تفسير النتائج يجب أن تكون مجهزة المجهر مضان يستخدم لفحص الشريحة مع تصفية النطاق المزدوج AdvanDx وهدف النفط 60x أو 100X. وينبغي دراسة الشرائح QC أول تأكيد أن التهجين لم يحدث. E. وينبغي أن تبدو وكأنها البرازية مكورات مشرق الفلورية الخضراء في حقول متعددة من عرض وfaecium E. سوف تظهر مكورات أحمر مشرق. وينبغي عدم الانزلاق السيطرة المعوية تظهر nonfluorescent. بعد التأكد من نظام الضوابط ، يمكن فحص الشرائح المريض. في البداية فيل الدمسوف تظهر م المحمر ولكن حمراء زاهية ومكورات الخضراء سوف يكون واضحا تماما. <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> أمثلة الممثل الشكل 1. الخضراء إيجابية E. البرازية (يسار) ، والأحمر إيجابية E. faecium (وسط) ، ونتائج الاختبار سلبية (يمين). 10. ممثل النتائج شملت ثلاث مؤسسات في محاكمة متعددة المراكز السريرية تقييم هذا السمك السلطة الوطنية الفلسطينية وصمة عار ومقارنة بروتوكول 2.5 ساعة إلى 1.5 ساعة تقصير بروتوكول للتو تم استعراضها. ما مجموعه 152 الروتينية مكورات إيجابية الجرام في أزواج وسلاسل (GPC) أدرجت ثقافة إيجابية زجاجات الدم في هذه الدراسات. كان هناك 100 ٪ (152/152) اتفاق بين نتائج معدلة وإجراءات الفحص الأصلي للE. البرازية / عمر الفاروق FISH السلطة الوطنية الفلسطينية : 41/41 هاء البرازية ؛ المعوية الأخرى 33/33 و 78/78 GPC أخرى (الجدول 1). وكان هذا الأسلوب تلطيخ حساسية وخصوصية رائعة خلال هذه التجارب السريرية (الجدول 2). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> أساليب روتينية </td><td> هاء البرازية / عمر الفاروق قياسي FISH السلطة الإجرائية </td><td> هاء البرازية / عمر الفاروق الداخلي FISH السلطة الوطنية الفلسطينية القصيرة </td></tr><tr><td> البرازية E. </td><td> 41 </td><td> 41 (الأخضر ايجابي) </td><td> 41 (الأخضر ايجابي) </td></tr><tr><td> هاء faecium </td><td> 27 </td><td> 27 (الأحمر ايجابي) </td><td> 27 (الأحمر ايجابي) </td></tr><tr><td> هاء casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2 (الأحمر ايجابي) </td><td> 2 (الأحمر ايجابي) </td></tr><tr><td> هاء الدجاجي </td><td> 2 </td><td> 2 (الأحمر ايجابي) </td><td> 2 (الأحمر ايجابي) </td></tr><tr><td> المعوية الأخرى النيابة. </td><td> 2 </td><td> 2 (الأحمر ايجابي) </td><td> 2 (الأحمر ايجابي) </td></tr><tr><td> س. الرئوية </td><td> 17 </td><td> 17 (السلبية) </td><td> 17 (السلبية) </td></tr><tr><td> S. المخضرة </td><td> 33 </td><td> 33 (السلبية) </td><td> 33 (السلبية) </td></tr><tr><td> S. هين </td><td> 1 </td><td> 1 (السلبية) </td><td> 1 (السلبية) </td></tr><tr><td> س. المقيحة </td><td> 3 </td><td> 3 (السلبية) </td><td> 3 (السلبية) </td></tr><tr><td> S. البقرية </td><td> 2 </td><td> 2 (السلبية) </td><td> 2 (السلبية) </td></tr><tr><td> S. اللعابية </td><td> 1 </td><td> 1 (السلبية) </td><td> 1 (السلبية) </td></tr><tr><td> S. الدم </td><td> 2 </td><td> 2 (السلبية) </td><td> 2 (السلبية) </td></tr><tr><td> S. agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7 (السلبية) </td><td> 7 (السلبية) </td></tr><tr><td> العقدية الأخرى النيابة. </td><td> 7 </td><td> 7 (السلبية) </td><td> 7 (السلبية) </td></tr><tr><td> تضاؤل ​​الحيوية النيابة. </td><td> 3 </td><td> 3 (السلبية) </td><td> 3 (السلبية) </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus النيابة. </td><td> 2 </td><td> 2 (السلبية) </td><td> 2 (السلبية) </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 152 </td><td> 152/152 اتفاق 100 ٪ </td><td> 152/152 اتفاق 100 ٪ </td></tr></tbody></table> اختبار الجدول 1. اظهر من البكتيريا باستخدام كل معيار (2.5hr) وبروتوكول السريع (1.5 ساعة). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> حساسية E.faecalis </td><td> حساسية أخرى معوي النيابة. </td><td> خصوصية </td></tr><tr><td> 100 ٪ (41/41) CI 95 ٪ (93،0 حتي 100) </td><td> 100 ٪ (33/33) 33/33 CI 95 ٪ (91،3 حتي 100) </td><td> 100 ٪ (78/78) CI 95 ٪ (96،2 حتي 100) </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الحساسية والنوعية للبروتوكول 1.5 ساعة FISH السلطة الوطنية الفلسطينية.

<ol>
	<li>Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures+by+dual+color+fluorescence+in+situ+hybridization+using+PNA+probes.">Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes.</a> , (2002).</li><li>Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+E.+faecalis+PNA+FISH+for+rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures.">Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures.</a> , (2003).</li><li>Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+Staphylococcus+aureus,+Enterococcus+faecalis,+and+Candida+albicans+from+blood+cultures+using+fluorescence+in+situ+hybridization+with+nucleic+acid+probes.">Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes.</a> , (2005).</li><li>Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+S.+aureus+PNA+FISH,+E.+faecalis+PNA+FISH+&#38;+C.+albicans+PNA+FISH+for+Rapid+Identification+of+Positive+Blood+Culture+Bottles.">Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH &#38; C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles.</a> , (2006).</li><li>Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Identification+of+Enterococcus+Species+in+Positive+Blood+Cultures+with+Therapeutic+Implications.">Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications.</a> , (2006).</li></ol>

وقد رعت إنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو AdvanDx. بنيامين كريستال هو موظف من AdvanDx ، الذي يجعل من الأدوات والكواشف المستخدمة في هذه المقالة.

وهاء يمكن البرازية / عمر الفاروق مقايسة FISH السلطة الوطنية الفلسطينية لتوفير تحديد معوي 2-3 أيام في وقت سابق من طرق الثقافة القياسية. إجراء تقصير للمقايسة (1.5 hourr) على التعرف السريع والتي يمكن استخدامها لتحسين النهج المتبع في العلاج المضادة للميكروبات ونتائج المرضى. وقد أجريت دراسة واحدة لدعم هذا عن طريق فورست ، وآخرون (6). على مدى سنتين متتاليتين ابتداء من عام 2005 حددت مختبر الميكروبيولوجيا مكورات إيجابية الجرام في أزواج وسلاسل المتزايد في زجاجات ثقافة الدم عن طريق الأساليب التقليدية والميكروبيولوجية في عام 2006 مضيفا ان E. البرازية / عمر الفاروق السلطة الوطنية الفلسطينية الأسماك. بالإضافة خوارزمية العلاج التي وضعها فريق المؤسسات مضادات الميكروبات (AMT) على الاستخدام الفعال للبيانات السمكية السلطة الوطنية الفلسطينية التي تم إنشاؤها بواسطة المختبر في الوقت المناسب. والنتيجة الأولية المقررة الوقت من ثقافة الدم التعادل لتنفيذ المعالجة الفعالة المضادة للجراثيم قبل وبعد وضعت السلطة الوطنية الفلسطينية السمكية في سير عمل المختبرات. تم قياس شدة الموقع ، ومرض المريض والعلاج تجريبية مضادة للميكروبات. وجرى تقييم ما مجموعه 224 مريضا في المستشفى حصلت مع enterococcal تجرثم مع 129 في الفترة التي سبقت التدخل و 95 في الفترة FISH السلطة الوطنية الفلسطينية. حددت السلطة الوطنية الفلسطينية FISH E. البرازية 3 أيام في وقت سابق من الثقافات التقليدية (1.1 مقابل 4.1 يوم ، ف &lt;0.001). حددت السلطة الوطنية الفلسطينية FISH E. faecium الوسيط 2.3 يوم في وقت سابق (1.1 مقابل 3.4 يوم ، ف &lt;0.001) وكان مرتبطا مع تخفيضات كبيرة إحصائيا في الوقت المناسب لبدء العلاج الفعال (1.3 مقابل 3.1 يوم ، ف &lt;0.001) ، وانخفض لمدة 30 يوما وفيات (26 ٪ مقابل 45 ٪ ، ع = 0.04). وخلص إلى أن هذه المجموعة E. أسفرت البرازية / عمر الفاروق مقايسة السمكية بالتعاون مع السلطة الوطنية الفلسطينية خوارزمية AMT العلاج في وقت سابق من بدء العلاج المناسب التجريبية المضادة للميكروبات للمرضى المصابين بعدوى المستشفيات E. faecium تجرثم الدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن لا تستعمل الكواشف بعد لا ينبغي تواريخ انتهاء الصلاحية المطبوع على التسميات والكواشف يمكن تعديلها في أي شكل من الأشكال. ينبغي أن تبقى في الثلاجة عندما لا تكون قيد الاستعمال أو أنها يمكن أن تفقد قوتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة زجاجات الدم تحتاج إلى أن تكون مختلطة قبل أخذ العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم عدم السماح للطرف زجاجة بالقطارة للمس مسحة الدم لأن هذا قد يسبب تلوث المواد عبر بين الشرائح ، أو التسبب في تلوث الكاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من المحافظة على المياه والاستحمام كتلة التدفئة في 55 درجة مئوية ثابتة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تستخدم سوى مرشحات تصفية النطاق المزدوج أو الألوان لن يتم تمييزها بوضوح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تستخدم شرائح مجهرية أخرى من شرائح ميكروسكوب أو التهجين لن يحدث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم أن مجهر يعمل بشكل صحيح. تأكد من لمبة المجهر هو ضمن عدد من الساعات المعتمدة للاستخدام. </li></ol><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لم يتم الكشف عن بعض الأنواع النادرة التي تحدث المعوية عن طريق المسبار السلطة الوطنية الفلسطينية لأنواع التهجين المعوية الأخرى ، مثل asinii E. ، E.dispar ، haemoperoxidus E. ، cecorum E. ، columbae E. ، saccharolyticus E. ، المفرد هاء وهاء . كبريتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعريف هاء هاء كما moraviensis بسبب التشابه تسلسل البرازية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعض سلالات بكتيريا تنتج ذبحية مضان إيجابية كاذبة الأخضر بسبب التشابه تسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لم يتم تقييمها زجاجات VersaTREK ثقافة الدم خلال الدراسات السريرية. أداء للكشف عن E. والمعوية البرازية غيرها من النيابة. مع زجاجات VersaTREK ثقافة الدم غير معروف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد تألق ذاتي الخضراء إيجابية كاذبة تحدث إذا تم استخدام معيار FITC مرشح بدلا من تصفية النطاق المزدوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تحدث نتائج سلبية كاذبة نادرا بسبب النمو مختلطة أو بسبب خطأ في تقنية الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونوع وحالة الأجهزة المستخدمة تؤثر على المظهر المرئي للصورة التي تم الحصول عليها. قد مضان varydue لنوع المجهر العاملين ، ومصدر الضوء ومستوى الرنا الريباسي في الخلايا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هناك حاجة إلى عزلة على وسائل الاعلام الصلبة للتمييز نمو مختلطة مع غيرها من الكائنات وتحديد مزارع الدم ايجابية مما أسفر عن النتيجة السلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لم يتم التحقق من صحة المنتج مع عينات أخرى من الثقافات الدم. </li></ul>

الكواشف وتتألف E. البرازية / عمر الفاروق FISH السلطة الوطنية الفلسطينية من عدة عناصر التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محلول التثبيت التثبيت الحل 3 مل الفوسفات مخزنة المالحة مع المنظفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هاء البرازية / عمر الفاروق السلطة الوطنية الفلسطينية E. البرازية / عمر الفاروق السلطة الوطنية الفلسطينية 1.5 مل تحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية في التهجين. الحل. يحتوي formamide 30 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغسل 60x 60x الحل الحل اغسل تريس - 50 مل مخزنة المالحة مع المنظفات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصاعد تصاعد متوسطة المانع متوسطة 3 مل photobleaching في الجلسرين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرائح لمراقبة الجودة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDX</a> </li></ul>

a 1.5 hour procedure for identification of enterococcus species directly from blood cultures

المعوية هي سبب شائع للتجرثم مع هاء البرازية هي الأنواع السائدة تليها faecium هاء. لأن المقاومة للأمبيسلين وفانكومايسين في E. لا يزال من غير المألوف مقارنة البرازية المقاومة في faecium هاء ، وتطوير الاختبارات السريعة السماح التفريق بين الأنواع enterococcal المهم للعلاج المناسب والمراقبة المقاومة. وهاء البرازية FISH السلطة الوطنية الفلسطينية OE مقايسة (AdvanDx ، وبرن ، MA) يستخدم أنواعا معينة من الحيوانات الببتيد حمض النووي (السلطة الفلسطينية) تحقيقات في مضان التهجين في تنسيق الموقع ويوفر الوقت لنتائج 1.5 ساعة وإمكانية توفير معلومات مهمة عن أنواع محددة العلاج. وقد أجريت دراسات متعددة المراكز لتقييم أداء E. 1.5 ساعة البرازية / عمر الفاروق الداخلي FISH السلطة الوطنية الفلسطينية إلى إجراء مقارنة الأصلي مقايسة 2.5 ساعة وأساليب البكتريولوجيا معيار لتحديد المعوية مباشرة من زجاجة الدم ثقافة إيجابية.

Watch this Scientific Journal Video about A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures at JoVE.com

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

بروتوكول السريع لتحديد المباشرة للالمعوية البرازية والأنواع الأخرى من معوي ثقافة الدم إيجابية باستخدام حمض الببتيد الأحماض النووية في مقايسة فلوري التهجين الموضع (FISH السلطة الوطنية الفلسطينية).

إجراء 1.5 ساعة لتحديد معوي أنواع الثقافات مباشرة من الدم

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

a-15-hour-procedure-for-identification-enterococcus-species-directly

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

20.7K Views.  Cedars-Sinai Medical Cente. بروتوكول السريع لتحديد المباشرة للالمعوية البرازية والأنواع الأخرى من معوي ثقافة الدم إيجابية باستخدام حمض الببتيد الأحماض النووية في مقايسة فلوري التهجين الموضع (FISH السلطة الوطنية الفلسطينية).

Video: A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل<em&gt; بيركولديريا</em&gt; الأنواع

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

إجراءات لتحديد المعدية البريونات بعد المرور عبر الجهاز الهضمي لأنواع الطيور

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...