Des études ont été parrainées par AdvanDx.

1. Prélèvement et préparation <ol><li> Recueillir le sang veineux de patients soupçonnés d&#39;infection et mis dans deux BACTEC (BD, Sparks, MD) flacons d&#39;hémoculture, une aérobie et anaérobie une, ensemble comprenant un ensemble d&#39;hémoculture. </li><li> Placez les bouteilles dans le BACTEC 9240 l&#39;instrument à 35 ° C. </li><li> Incuber tant que l&#39;instrument est déclenchée une alarme en raison de la croissance des organismes dans le flacon d&#39;hémoculture. </li><li> Enlever la bouteille de l&#39;instrument de la culture du sang. </li></ol> 2. Préparation des réactifs avant la coloration <ol><li> Préparer la solution de lavage en ajoutant 4 ml de solution de lavage 60x suivi par 240 ml d&#39;eau déminéralisée ou distillée frais directement à l&#39;antenne de coloration. </li><li> Mettez le plat dans la coloration de 55 ° C à bain d&#39;eau tiède. </li><li> Stocker le concentré restant à 2-8 ° C. </li><li> Enlever le milieu de montage du réfrigérateur et à température ambiante. </li></ol> 3. La coloration de Gram <ol><li> Remuer doucement le flacon d&#39;hémoculture. </li><li> En utilisant une aiguille et la seringue ou d&#39;un appareil de repiquage, enlever le sang (environ 5 ml) de la bouteille et placer dans un tube à vis stériles plafonné. </li><li> En utilisant une pipette stérile, déposer une goutte de sang sur un grand une lame de microscope en verre. </li><li> L&#39;air sec de la lame et fixer au méthanol pendant 10 secondes. </li><li> Laisser sécher à l&#39;air glisser. </li><li> Effectuer une coloration de Gram sur le film de sang pour déterminer la morphologie de l&#39;organisme en croissance dans le flacon d&#39;hémoculture. </li><li> En utilisant un objectif à immersion d&#39;huile, affichage des diapositives. Cocci à Gram positif en paires et de courtes chaînes observées sur la coloration de Gram est la plus compatible avec les espèces Enterococcus. </li><li> Ce résultat Gram entraîne alors le choix de la trousse appropriée ANP sonde FISH à utiliser pour l&#39;identification bactérienne. Cette culture de sang seront colorées à l&#39;aide de la E. faecalis / OE PNA FISH tache. </li></ol> 4. PNA FISH Stain <ol><li> Mélanger le tube contenant le sang doucement en remuant avant la préparation du frottis. </li><li> Déposer une goutte de solution de fixation sur le bien d&#39;une diapositive ANP Microscope FISH. </li><li> Transfert 10 uL ou une petite goutte du tube avec l&#39;hémoculture positive à la solution de fixation et mélanger délicatement pour émulsionner. </li><li> Fixer le frottis en les chauffant pendant 20 min. à 55 ° C sur une plaque chauffante. </li></ol> 5. Matériel de contrôle de qualité Une positive et négative d&#39;une diapositive de contrôle de qualité doivent être testés avec chaque lot de lames pour la coloration. <ol><li> Utilisez E. faecalis / OE contrôle Diapositives acheté AdvanDx à cet effet ou préparer des frottis de cultures liquides des souches de référence de E. faecalis et E. faecium de contrôle positif, soit sur ​​des lames séparées ou mélangées sur une lame et Staphylococcus spp ou Streptococcus spp comme matériau de contrôle négatif. </li></ol> Les résultats du CQ devraient être capables de surveiller les conditions d&#39;essai appropriées, en particulier ceux qui affectent la rigueur d&#39;hybridation et la pénétration de la paroi cellulaire, puisque la méthodologie PNA est conçu pour optimiser la pénétration des parois cellulaires 6. Hybridation <ol><li> Ajouter une goutte de E. faecalis / OE PNA pour le bien sur la lame de microscope avec le frottis. </li><li> Ajouter lamelle. Eviter les bulles d&#39;air. </li><li> Incuber pendant 30 ± 5 min. à 55 ± 1 ° C sur plaque chauffante </li><li> Après une incubation lieu les diapositives dans le support glisser </li></ol> 7. Lavez strictes <ol><li> Porteuse glisser Plongez dans la solution de lavage préchauffé à 55 ° C et retirer délicatement la lamelle. Souvent, la lamelle glisse par les agitant doucement la lame dans la solution de lavage. Occasionnellement, la lamelle doit être doucement poussés hors avec une pince. </li><li> Incuber dans la solution de lavage pendant 30 ± 5 min. à 55 ± 1 ° C. </li><li> Retirez les diapositives de la solution de lavage </li><li> Laisser la lame sécher à l&#39;air </li></ol> 8. Montage <ol><li> Ajouter une goutte de milieu de montage à chaque diapositive </li><li> Ajouter lamelle. Eviter les bulles d&#39;air. </li><li> Examiner la lame sur un microscope à fluorescence dans les 2 heures. </li><li> Ne pas exposer les diapositives à la lumière directe du soleil ou d&#39;autres sources de lumière forte, car cela pourrait conduire à l&#39;extinction de fluorescence. </li></ol> 9. Interprétation des résultats Le microscope à fluorescence utilisé pour l&#39;examen diapositive doit être équipé du filtre Dual Band AdvanDx et un objectif 60x ou 100x huile. Les diapositives doivent être examinées QC premier à confirmer que l&#39;hybridation ne se produisent. E. faecalis doit apparaître comme un vert brillant fluorescent cocci dans de multiples domaines de vue et les E. faecium apparaîtra comme un rouge vif cocci. Lame de contrôle non-entérocoques devrait apparaître non fluorescent. Après avoir vérifié le système de contrôle, les diapositives des patients peuvent être examinés. Au début, le fil de sangm apparaîtra rouge mais le rouge vif et vert cocci sera tout à fait évident. <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Des exemples représentatifs Figure 1. De vert-positif E. faecalis (à gauche), positif rouge E. faecium (au milieu), et les résultats des tests négatifs (à droite). 10. Les résultats représentatifs Trois institutions ont été inclus dans un essai clinique multicentrique évaluant ce PNA FISH taches et comparant un protocole 2,5 heures à l&#39;heure raccourcie 1.5 du protocole qui vient d&#39;être examiné. Un total de 152 cocci à Gram positif en paires de routine et des chaînes (GPC) flacons d&#39;hémoculture positifs ont été inclus dans les études. Il était de 100% (152/152) accord entre les résultats de l&#39;modifiée et la procédure de dosage original de E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 et 78/78 autres entérocoques GPC d&#39;autres (tableau 1). Cette méthode de coloration a une sensibilité exquise et une spécificité au cours de cet essai clinique (tableau 2). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Méthodes de routine </td><td> E. faecalis / OE procédure standard ANP POISSONS </td><td> E. faecalis / OE procédure ANP POISSONS court </td></tr><tr><td> E. faecalis </td><td> 41 </td><td> 41 (Vert Positif) </td><td> 41 (Vert Positif) </td></tr><tr><td> E. faecium </td><td> 27 </td><td> 27 (Rouge Positif) </td><td> 27 (Rouge Positif) </td></tr><tr><td> E. casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2 (Rouge Positif) </td><td> 2 (Rouge Positif) </td></tr><tr><td> E. gallinarum </td><td> 2 </td><td> 2 (Rouge Positif) </td><td> 2 (Rouge Positif) </td></tr><tr><td> Autres Enterococcus spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (Rouge Positif) </td><td> 2 (Rouge Positif) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td> 17 </td><td> 17 (négatif) </td><td> 17 (négatif) </td></tr><tr><td> S. viridans </td><td> 33 </td><td> 33 (négatif) </td><td> 33 (négatif) </td></tr><tr><td> S. mitis </td><td> 1 </td><td> 1 (négatif) </td><td> 1 (négatif) </td></tr><tr><td> S. pyogenes </td><td> 3 </td><td> 3 (négatif) </td><td> 3 (négatif) </td></tr><tr><td> S. bovis </td><td> 2 </td><td> 2 (négatif) </td><td> 2 (négatif) </td></tr><tr><td> S. salivarius </td><td> 1 </td><td> 1 (négatif) </td><td> 1 (négatif) </td></tr><tr><td> S. sanguinis </td><td> 2 </td><td> 2 (négatif) </td><td> 2 (négatif) </td></tr><tr><td> S. agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7 (négatif) </td><td> 7 (négatif) </td></tr><tr><td> Autres Streptococcus spp. </td><td> 7 </td><td> 7 (négatif) </td><td> 7 (négatif) </td></tr><tr><td> Abiotrophia spp. </td><td> 3 </td><td> 3 (négatif) </td><td> 3 (négatif) </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (négatif) </td><td> 2 (négatif) </td></tr><tr><td> Total des </td><td> 152 </td><td> 152/152 100% Accord </td><td> 152/152 100% Accord </td></tr></tbody></table> Listing Tableau 1. De bactéries testées en utilisant à la fois la norme (2.5hr) et rapide (1,5 h) protocole. <table border="1"><tbody><tr><td> Sensibilité E.faecalis </td><td> Sensibilité autres Enterococcus spp. </td><td> La spécificité </td></tr><tr><td> 100% (41/41) 95% (de 93,0 à 100) CI </td><td> 100% (33/33) 33/33 95% (de 91,3 à 100) CI </td><td> 100% (78/78) 95% (de 96,2 à 100) CI </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Sensibilité et spécificité du protocole de PNA FISH 1,5 heures.

<ol>
	<li>Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures+by+dual+color+fluorescence+in+situ+hybridization+using+PNA+probes.">Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes.</a> , (2002).</li><li>Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+evaluation+of+E.+faecalis+PNA+FISH+for+rapid+identification+and+differentiation+of+Enterococcus+faecalis+and+other+Enterococcus+species+directly+from+positive+blood+cultures.">Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures.</a> , (2003).</li><li>Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+Staphylococcus+aureus,+Enterococcus+faecalis,+and+Candida+albicans+from+blood+cultures+using+fluorescence+in+situ+hybridization+with+nucleic+acid+probes.">Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes.</a> , (2005).</li><li>Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+S.+aureus+PNA+FISH,+E.+faecalis+PNA+FISH+&#38;+C.+albicans+PNA+FISH+for+Rapid+Identification+of+Positive+Blood+Culture+Bottles.">Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH &#38; C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles.</a> , (2006).</li><li>Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Identification+of+Enterococcus+Species+in+Positive+Blood+Cultures+with+Therapeutic+Implications.">Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications.</a> , (2006).</li></ol>

La production de cette vidéo a été parrainé par l&#39;article AdvanDx. Benjamin Crystal est un employé d&#39;AdvanDx, qui rend les outils et les réactifs utilisés dans cet article.

Le E. faecalis / OE test PNA FISH d&#39;entérocoques peuvent fournir une identification 2-3 jours plus tôt que les méthodes standard de culture. La procédure abrégée pour le dosage (1,5 hourr) permet une identification rapide qui peut être utilisé pour une meilleure approche de la thérapie antimicrobienne et les résultats des patients. Une étude à l&#39;appui de cette a été réalisée par Forrest et al. (6). Plus de deux années consécutives à partir de 2005, le laboratoire de microbiologie identifié cocci à Gram positif en paires et les chaînes de plus en plus par des flacons d&#39;hémoculture méthodes microbiologiques traditionnelles et en 2006, ajoutant le E. faecalis / OE PNA FISH. En outre, un algorithme de traitement élaboré par l&#39;équipe des institutions antimicrobiens (AMT) pour utiliser efficacement les données générées PNA FISH par le laboratoire dans les meilleurs délais. Principal résultat a été évaluée de temps à partir d&#39;hémocultures attirer l&#39;application de la thérapie antimicrobienne efficace avant et après PNA FISH a été institué dans le workflow des laboratoires. Gravité de la maladie, la localisation des patients et de traitement antimicrobien empirique ont été mesurés. Un total de 224 patients atteints de bactériémies nosocomiales à entérocoques ont été évalués à 129 dans la période d&#39;intervention pré-et 95 dans la période de PNA FISH. PNA FISH identifié E. faecalis trois jours plus tôt que les cultures conventionnelles (1,1 vs 4,1 jours, p &lt;0,001). PNA FISH identifié E. faecium une médiane de 2,3 jours plus tôt (1,1 vs 3,4 jours, p &lt;0,001) et a été associée à une réduction statistiquement significative du temps d&#39;entreprendre un traitement efficace (1,3 vs 3,1 jours, p &lt;0,001) et une diminution de 30 jours de mortalité (26% vs 45%, p = 0,04). Ce groupe a conclu que les E. faecalis / OE test PNA FISH en conjonction avec un algorithme de traitement AMT a entraîné un démarrage plus précoce du traitement empirique antimicrobien approprié pour les patients atteints acquises à l&#39;hôpital E. faecium bactériémie. <ol><li> Réactifs ne doit pas être utilisé après la date d&#39;expiration imprimée sur les étiquettes et les réactifs ne doivent pas être modifiés en aucune façon. Ils devraient rester dans le réfrigérateur lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé ou ils pourraient perdre de puissance. </li><li> Flacons d&#39;hémoculture doivent être mélangés avant l&#39;échantillonnage. </li><li> Il est important de ne pas permettre à l&#39;embout du flacon compte-gouttes toucher un frottis sanguin, car cela peut provoquer une contamination croisée du matériel entre les diapositives, ou provoquer une contamination du réactif. </li><li> Assurez-vous que l&#39;eau du bain et le bloc de chauffage sont maintenus à une constante de 55 ° C. </li><li> Ne pas utiliser d&#39;autres filtres que les filtres Dual Band ou les couleurs ne seront pas clairement discernées. </li><li> Ne pas utiliser des lames de microscope autres que les lames de microscope ou d&#39;hybridation ne se produira pas. </li><li> Il est important que le microscope fonctionne correctement. Assurez-vous que l&#39;ampoule microscope est dans le nombre d&#39;heures approuvées pour l&#39;utilisation. </li></ol><ul><li> Certaines espèces rares survenant Enterococcus ne sont pas détectés par la sonde PNA s&#39;hybrider avec les espèces Enterococcus autres, comme E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, saccharolyticus, E. solitarius et E . sulfureuse. </li><li> Moraviensis E. est identifié comme E. faecalis en raison de similarités de séquence. </li><li> Certaines souches de Streptococcus anginosus produire une fausse fluorescence verte positif en raison de similarités de séquence. </li><li> Bouteilles VersaTREK hémoculture n&#39;ont pas été évaluées au cours des études cliniques. La performance pour détecter E. faecalis et d&#39;autres Enterococcus spp. avec des bouteilles VersaTREK hémoculture est inconnue. </li><li> Faux positifs autofluorescence verte peut se produire si une norme filtre FITC est utilisé au lieu du filtre Dual Band. </li><li> Résultats faux négatifs peuvent se produire fréquemment en raison de la croissance mixte ou due à une erreur dans la technique de dosage. </li><li> Le type et l&#39;état de l&#39;instrumentation utilisée va influencer l&#39;aspect visuel de l&#39;image obtenue. La fluorescence peut varydue le type de microscope utilisé, la source lumineuse et le niveau de l&#39;ARNr dans les cellules </li><li> Isolement sur milieu solide est nécessaire de différencier la croissance mélangé avec d&#39;autres organismes et d&#39;identifier les hémocultures positives qui donne un résultat négatif. </li><li> Le produit n&#39;a pas été validée avec des échantillons autres que les cultures de sang. </li></ul>

Réactifs E. faecalis / OE PNA FISH est composé des composants du kit suivantes: <ul><li> Solution de fixation Fixation Solution 3 ml tampon phosphate salin avec du détergent. </li><li> E. faecalis / OE ANP E. faecalis / OE ANP 1,5 mL sondes PNA dans l&#39;hybridation. solution. Contient 30% de formamide. </li><li> Lavez 60x Solution Solution de lavage 60x 50 mL de Tris-solution saline tamponnée avec un détergent </li><li> Milieu de montage Montage inhibiteur ml Moyen 3 photoblanchiment dans le glycérol </li><li> Lames de contrôle de la qualité </li><li> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDx</a> </li></ul>

a 1.5 hour procedure for identification of enterococcus species directly from blood cultures

Les entérocoques sont une cause fréquente de bactériémie à E. faecalis étant l&#39;espèce prédominante suivie par E. faecium. Parce que la résistance à l&#39;ampicilline et à la vancomycine dans E. faecalis est encore rare comparée à la résistance de E. faecium, le développement de tests rapides permettant la différenciation entre les espèces entérocoques est important pour un traitement approprié et la surveillance de la résistance. Le E. faecalis OE test PNA FISH (AdvanDx, Woburn, MA) utilise des espèces spécifiques d&#39;acides nucléiques peptides (PNA) des sondes dans une fluorescence en format hybridation in situ et offre un temps de résultat de 1,5 heures et le potentiel de fournir des informations importantes pour les espèces spécifiques traitement. Études multicentriques ont été effectuées pour évaluer la performance de l&#39;1,5 heures E. faecalis / OE procédure de PNA FISH par rapport à la procédure de dosage 2,5 heures original et aux méthodes de la bactériologie standard pour l&#39;identification des entérocoques directement d&#39;un flacon d&#39;hémoculture positive.

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Un protocole rapide pour l&#39;identification directe de Enterococcus faecalis et Enterococcus autre d&#39;une hémoculture positive en utilisant un acide nucléique peptidique fluorescentes test d&#39;hybridation in situ (FISH ANP).

Une procédure de 1,5 heure pour l&#39;identification des Enterococcus Espèces directement à partir d&#39;hémocultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

a-15-hour-procedure-for-identification-enterococcus-species-directly

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

20.7K vues.  Cedars-Sinai Medical Cente. Un protocole rapide pour l'identification directe de Enterococcus faecalis et Enterococcus autre d'une hémoculture positive en utilisant un acide nucléique peptidique fluorescentes test d'hybridation in situ (FISH ANP).

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Recherche

Immunologie et infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procédures d&#39;identification des prions infectieux Après passage dans le système digestif d&#39;une espèce aviaire

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l&#39;aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Préparation d&#39;une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...