نشكر أعضاء Meshorer المختبر ، وخاصة شاي Melcer ، Alajem عدي ، Edupuganti رام راغو بديع Sailaja لانكا ، وآنا Mattout بيران ألفا ، لتعليقات انتقادية وتحديد مواطن الخلل في التجارب photobleaching على أساس يومي. EM هو H. R. جوزيف وبيلي براون أستاذ محاضر في علوم الحياة ومعتمد من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل (ISF 943/09) ، ووزارة الصحة الإسرائيلية (6007) والاتحاد الأوروبي (IRG - 206872 و 238176) ، إسرائيل للسرطان مؤسسة أبحاث ، والمنح الداخلية طبية تطبيقية في الجامعة العبرية ومعهد أو الرعاية اسرائيل.

1. طلاء للخلايا ES T = 0 ساعات MEF تصفيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف التصوير يعيش جيدا μ - 8 - الشرائح (ibidi ؛ ميونيخ ، ألمانيا) مع الجيلاتين أو في غرف تغطية النظارات (لاب تيك ؛ روتشستر ، نيويورك) أو في أطباق زجاجية الثقافة القاع (ماتيك ؛ آشلاند ، MA). 50-30 دقيقة للمغادرة ونضح بعيدا الجيلاتين الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 22000 MEFs / جيدا في حجم اجمالي 250 ميكرولتر من DMEM [تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ (FBS)]. السماح لزراعة الخلايا في نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2). </li></ol> T = 6 ساعات ES خلية الطلاء <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل البذور MEF مغلفة بشكل جيد مع خلايا 15000 R1 / جيدا في حجم اجمالي 250 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلية ES [تستكمل مع مصل الجنين بنسبة 10 ٪ ESC الصف البقر (FBS) ، 1 البيروفات الصوديوم ملم ، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 0.1 ملم β المركابتويثانول ، و 1000 عامل اللوكيميا يو / مل المثبطة (LIF)] ، والحصول على 30 ٪ إلى 50 ٪ التقاء في اليوم التالي. </li></ol> 2. Transfecting خلايا ES T = 24 ساعة عابر ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وسائل الإعلام الخلية وفاق مع 250 ميكرولتر / بئر جديدة وسائل الاعلام وفاق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب اختبار 1.5 مل العقيمة ، إضافة 100 مصل وسائل الاعلام الحرة ميكرولتر [OPTI - MEM (Gibco)] ، ثم إضافة 10 العابر LT1 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن (Mirus) مباشرة في وسائل الاعلام الحرة في المصل. مزيج لطيف من قبل pipetting ويحضن في درجة حرارة الغرفة ل50-20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الانصهار 1،5 ميكروغرام GFP DNA البلازميد (H1e ، أو H1o HP1) إلى المخفف العابر LT1 كاشف. مزيج لطيف من قبل pipetting ويحضن في درجة حرارة الغرفة ل15-30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 13.5 ميكرولتر / الخليط جيدا ترنسفكأيشن. دوامة 8 - μ - الشرائح جيدا لضمان انتشار أكبر. بعد 24 ساعة يحل محل الخلايا القديمة وفاق وسائل الاعلام مع 250 ميكرولتر من خلية جديدة وسائل الاعلام وفاق. </li></ol> 3. أداء FRAP وFLIP T = 48-72 ساعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إجراء التجربة على أي مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر (CLSM) ولكن منذ ذلك الحين في تجربة FRAP / FLIP العادية ، يتم الحصول على العديد من الصور المتتالية ، فمن المستحسن استخدام المجهر الغزل القرص مبائر ، والتي تمكن سرعة اقتناء ويضمن أن لا وعينة غير مرغوب فيها تبيض تحدث بعد الحدث الأولي المتعمد التبييض. هنا ، ونحن نوصي باستخدام الثورة الغزل نظام القرص مبائر (www.Andor.com) ، مع CSU - X يوكوجاوا رئيس القرص الغزل. هذا النظام لديه القدرة المزدوجة لphotobleach باستخدام وحدة متخصصة FRAPPA نقطة مع نظام المسح الضوئي ، والتبديل بسرعة الضوء مرة أخرى لجمع الصور باستخدام القرص الغزل. والبروتينات 3 الاستشعاع الأكثر شيوعا لphotobleaching التجارب هي GFP ، YFP والكرز. إذا استخدمت أو GFP YFP ، مطلوب ~ الليزر 488 نانومتر. لالكرز ، واستخدام ليزر ~ 560 نانومتر. في جميع الحالات ، ونحن نوصي باستخدام الليزر في الحالة الصلبة. بعد مرحلة الآلي هو مفيد ولكن ليس المطلوب. حيث يتم تصوير الخلايا الحية ، فمن الضروري لاستخدام الغرفة البيئية (التي نستخدمها واحد من LIS ، سويسرا) ، والأكسجين السيطرة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون (2) ودرجة الحرارة. يتم تنفيذ FRAP تستخدم الحد الأقصى لكثافة الليزر ، بينما يتم التصوير مع قوة الليزر الحد الأدنى المطلوب (عادة في المنطقة بنسبة 10 ٪ ، عند مستوى الاستشعاع الكافي). مراقبة الخلايا مع ضوء الفلورسنت من الطول الموجي المناسب وحدد خلية معربا عن GFP باستخدام الغمر النفط 60X العدسة. ضمان التوزيع الصحيح التحت خلوية. أحيانا ، عند مستويات مرتفعة للغاية التعبير ، قد التوطين في البروتين &quot;تسرب&quot; لالمقصورات الأخرى مثل نوية. لا ينبغي أن تكون مثل هذه الخلايا المحددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن تعيين بروتوكول التصوير : جمع الإطارات 3-5 قبل photobleaching ، ثم photobleach في كروماتين حقيقي أو المغاير (ينظر إليها على أنها بؤر مكثف GFP) وجمع الإطارات 90-120 بعد photobleach ، مع فترات مللي 250-1000 : H1e - GFP ، 1000 مللي ، وH1o HP1 - GFP ، 250 مللي ثانية (الوقت الفاصل التغييرات وفقا لديناميات البروتين ، حيث البروتينات ديناميكية للغاية تتطلب فترة زمنية أقصر). نستخدم عادة 8-10 ٪ كثافة ليزر لphotobleaching مع نبضة ليزر من μseconds 20-40 (1-2 تكرارات) ، ولكن هذه الأرقام يمكن أن تتغير وفقا لتحليل البروتينات ومستويات التعبير. عندما photobleaching غير مناسبة ، يجب الانتباه إلى &quot;ثقب أسود&quot; في مضان GFP الخاص. تدريجيا الثقب الأسود إعادة الانتعاش التالية مليئة مضان. على الرغم من أن القرص الغزل يمكن الحصول على ما يصل الى نحو 60 صورة في الثانية الواحدة (مع كثافة مضان جيدة ، وعندما نركز اهتمامنا على خلية واحدة) ، ونحن لا نوصي باستخدام هذا النظام في مثل هذه السرعات العالية نظرا لجودة الصورة منخفضة والضيائية زيادة محتملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن تجربة الآخر ، إعداد بروتوكول التصوير المختلفة : 3-5 جمع الإطارات قبل التبييض ، ثم تبدأ المتكررة تبيض في نفس المكان في حين جمع الصور. لH1e - GFP ، التبييض كل ثانية 5 ، لH1o - GFP ، التبييض كل 2 ثانية ، وHP1 - GFP التبييض كل ثانية 1. التبييض anد جمع الصور مرارا وتكرارا طوال التجربة بأكملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اما عن تقنية ، كرر العملية على خلايا 20-30. للأغراض الإحصائية ، وتكرار التجربة 3 مرات أو أكثر ، ويفضل في أيام مختلفة. في المجتمعات المتجانسة والضبط الصحيح ، الانحراف المعياري هو عادة منخفضة (&lt;5 ٪). لكلا FRAP والوجه ، وحجم وشكل المنطقة ابيض يؤثر على ديناميكية الانتعاش ويجب أن يظل ثابتا في إطار التجربة. أيضا ، عندما تتم مقارنة خليتين ، يجب استخدام بروتوكولات متطابقة ويجب تحليل الخلايا بالتسلسل في نفس اليوم ليزر الطاقة وغيرها من الشروط قد تتغير ويمكن أن تؤثر على نتائج التجربة. </li></ol> 4. FRAP FLIP وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في جميع الأطر FRAP جمعها ، وقياس كثافة مضان في العائد على الاستثمار (ROI ب = منطقة ابيض) ، والمنطقة الخلفية (ROI BG) ، ومنطقة غير المقشور النووية (ROI ملحوظة) بوصفها وظيفة من الزمن قبل وبعد التبييض. ويمكن عند منطقة المبيضة لا يكاد يذكر سيتم اختيار نواة بأكملها لأغراض التطبيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل كل نقطة زمنية ، وتطبيع البيانات وفقا للصيغة : (ROI ب -- ROI BG) / (ROI ملحوظة -- ROI BG) / (pbROI ب -- pbROI BG) / (ملحوظة pbROI -- pbROI BG) ، ترمز للبرميل قبل المبيضة. لمرحلة ما قبل التبييض الصور يجب أن تحصل على قيمة 1 تقريبا. والصورة الأولى بعد التبييض تشير إلى العمق التبييض. طرح قيمة من 1 لقيمة بليتش العمق الفعلي. كرر لكل خلية ومتوسط ​​20-30 الخلايا من كل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FLIP في جميع الأطر التي تم جمعها ، وقياس كثافة مضان في منطقة غير المقشور النووية ، والمنطقة الخلفية (ROI ملحوظة = غير المقشور المنطقة ، وعائدات الاستثمار BG = الخلفية). حساب البيانات FLIP يشبه منحنى FRAP ، ينبغي فقط ROI تحليلها (ROI ملحوظة) تكون مختلفة من منطقة ابيض الفعلية ، والتي لا تستخدم في الحساب : (ROI ملحوظة -- ROI BG) / (ملحوظة pbROI -- pbROI BG) . ومن الممكن أيضا استخدام الخلايا المجاورة (ROI = ن خلية الجار) لأغراض التطبيع : (ROI ملحوظة -- ROI BG) / (ROI ن -- ROI BG) / (ملحوظة pbROI -- pbROI BG) / (pbROI ن -- pbROI BG ). بعد جمع البيانات ، فمن الممكن لاحتواء البيانات التجريبية لمحاكاة الكمبيوتر. وهذا يسمح حساب ، مع القرب جيدة ، والكسر المحمول ، وجزء متحرك والنصف كحد أقصى. لن نناقش الجوانب الرياضية والإحصائية لتحليل FRAP هنا وتحيل القارئ إلى منشورات أخرى ممتازة 4-9. عمق التبييض يشير إلى المسافة (على المحور الصادي) بين إشارة (100 ٪) ما قبل التبييض والصورة الأولى بعد التبييض ، والكسر المحمول يشير إلى المسافة (على المحور الصادي) بين عمق والتبييض إشارة عندما تعافى حركية تصل إلى الهضبة ، وجزء متحرك يشير إلى المسافة (على المحور ص) بين إشارة وتعافى قبل التبييض إشارة (100 ٪) (انظر الأرقام 1B و 2B). بعد هذا التحليل ، وهناك نماذج رياضية جيدة لاحتواء البيانات. للداعية واحد ، المعادلة  <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="معادلة" width="80" /> حيث t هو الوقت ، A هو جزء المحمول ، 1 - A هو جزء ثابت وك إيقاف التفكك المستمر ، يمكن استخدامها لاحتواء البيانات ، وتقدير المباشر لنسبة الخروج من الملزمة (ك إيقاف) يمكن أن يكون الحصول عليها ، فضلا عن المعلمة ألف ، والتي يمكن استخدامها لحساب معدل تكوين الجمعيات. </li></ol> 5. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. ألف وباء منحنيات FRAP تظهر ممثل HP1 (يسار) ، H1o (وسط) وH1e (يمين) في خلايا ES R1. عن الشكل 1A البساطة والوضوح ويبين البيانات الخام من خلية واحدة قبل أي تطبيع والحساب. المنحنى الأصفر يناظر المنطقة ابيض ، المنحنى الأرجواني يتوافق مع منطقة غير المقشور النووية (عند منطقة المبيضة لا يكاد يذكر ويمكن تحديد نواة بأكملها لأغراض التطبيع) ، والخط الأحمر يتوافق مع مضان الخلفية ، وهي الحد الأدنى في هذه القضية. السهم العمودي يمثل الوقت التبييض. وتظهر بيانات تطبيع وبلغ متوسط ​​في الشكل 1B. لاحظ تباطؤ انتعاش H1 (الأزرق) مقارنة مع HP1 (الحمراء). أيضا متغير H1e (أزرق غامق) أبطأ من المتغير H1o (الضوء الأزرق). يشار إلى كسور متحركة ومتنقلة والعمق لبليتش HP1. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 ألف وباء منحنيات FRAP تظهر المقارنة بين ممثل كروماتين حقيقي (اليسار) مع المغاير (يمين) في الخلايا من HP1 ES R1. وعلى غرار الشكل 1 ، ويبين الشكل 2A البيانات الخام من خلية واحدة ، ومنحنى الصفراء يناظر المنطقة ابيض ، منحنى الأرجواني يتوافق مع منطقة غير المقشور النووية ، والخط الأحمر يتوافق مع مضان الخلفية. السهم العمودي يمثل الوقت التبييض. وتظهر بيانات تطبيع وبلغ متوسط ​​2B في الشكل. لاحظ تباطؤ انتعاش المغاير (أحمر غامق) مقارنة مع كروماتين حقيقي (الضوء الأحمر). يشار إلى كسور متحركة ومتنقلة والعمق بليتش للكروماتين حقيقي. <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. ويرد تجربة نموذجية FLIP الخلايا H1o ES R1 في الشكل 3A (الخام ، وبرنامج الأمم المتحدة للتطبيع البيانات) وباء (تطبيع البيانات وبلغ متوسط). في هذه التجربة المنحنى الأرجواني يتوافق مع منطقة غير المقشور النووية ، فإن الخط الأخضر يناظر نواة الخلية المجاورة ، والخط الأحمر يتوافق مع مضان الخلفية.

<ol>
	<li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo:+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins.">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li><li>Meshorer, E., Girard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. , (2008).</li><li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , (2009).</li><li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching.">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li><li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells:+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis.">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li><li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus.">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li><li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics:+what+do+we+really+know.">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li><li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+TransgeneOmics:+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals.">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li><li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells.">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li><li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug.">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بخلاف معظم التقنيات المتاحة ، والتي تنطوي على لونين المنقى من السكان خلية أو خلايا ثابتة ، والتجارب FRAP متابعة التغيرات في ديناميات البروتين في الخلايا الحية لونين. وجدنا ديناميات البروتين لونين لتكون مؤشرا جيدا ليونة لونين. ومع ذلك ، لأنه يتطلب دمج الجينات في المصال...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> سيغما </td><td> D5671 </td></tr><tr><td> الجيلاتين </td><td> ميرك </td><td> 1.04078 </td></tr><tr><td> OPTI - MEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> العابر LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> 8 - جيدا μ - الشرائح </td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

photobleaching assays (frap &amp; flip) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells

الاسترداد بعد مضان Photobleaching (FRAP) وخسارة في الإسفار Photobleaching (FLIP) تمكن من دراسة ديناميات البروتين في الخلايا الحية مع جيدة القرار المكانية والزمانية. هنا نحن تصف كيفية تنفيذ FRAP والمقايسات FLIP لونين من البروتينات ، بما في ذلك H1 و HP1 في الخلايا الجنينية الماوس (ES) الجذعية. في تجربة FRAP ، يتم transfected الخلايا ، إما عابرة أو ثابت ، مع الاهتمام البروتين تنصهر مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) أو مشتقاتها (YFP ، CFP ، الكرز ، الخ). في الخلايا ، transfected الاستشعاع ، مكثفة تركز شعاع الليزر التبييض منطقة صغيرة نسبيا من الاهتمام (ROI). يتم تحديد طول الموجة الليزر وفقا لبروتين فلوري المستخدمة في الانصهار. ضوء الليزر التبييض لا رجعة فيه إشارة الفلورسنت من الجزيئات في العائد على الاستثمار ، ومباشرة بعد التبييض ، واستعادة للإشارة الفلورسنت في منطقة المبيض -- هو رصدها باستخدام التصوير مرور الوقت -- بوساطة استبدال جزيئات مبشور مع الجزيئات غير المبيض. ولدت في منحنيات الانتعاش مضان تقديم معلومات عن التنقل البروتين. إذا كانت الجزيئات الفلورسنت هي جامدة ، سوف يلاحظ أي انتعاش مضان. في اتباع نهج متكامل ، الخسارة في الإسفار Photobleaching (FLIP) ، شعاع الليزر التبييض نفس المكان مرارا وتكرارا ويتم قياس كثافة إشارة في أماكن أخرى في الخلية الاستشعاع. تجارب FLIP قياس بالتالي تسوس إشارة بدلا من الانتعاش مضان ومفيدة لتحديد التنقل ، فضلا عن البروتين البروتين في رحلات مكوكية بين مقصورات الخلوية. عابر ملزم هو خاصية مشتركة من لونين المرتبطة البروتينات. على الرغم من المحتم أن جزءا كبيرا من كل من البروتين لونين لونين في أي لحظة في حالة مستقرة ، وملزم هو عابر وبروتينات أكثر لونين وارتفاع معدل دوران على لونين ، مع وقت الإقامة في ترتيب ثواني. هذه الخصائص هي حاسمة لتوليد يونة عالية في التعبير الجينوم 1. تجارب Photobleaching بالتالي فهي مفيدة بشكل خاص لتحديد اللدونة باستخدام لونين GFP الانصهار إصدارات البروتينات الهيكلية لونين ، وخصوصا في خلايا ES ، حيث تبادل ديناميكي للبروتينات لونين (بما في ذلك البروتين المغاير 1 (HP1) ، H1 هيستون رابط وhistones الأساسية) هو أعلى من 2،3 في الخلايا المتمايزة.

Watch this Scientific Journal Video about Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

نحن تصف الأساليب بما في ذلك الاسترداد photobleaching بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) والخسارة في الإسفار Photobleaching (FLIP) لمراقبة ديناميات البروتين في الخلايا الجنينية لونين (ES) الجذعية. ويتعزز لونين ديناميات البروتين ، الذي يعتبر واحدا من الوسائل لدراسة اللدونة لونين ، في الخلايا المحفزة.

Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

photobleaching-assays-frap-flip-to-measure-chromatin-protein-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

27.0K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. نحن تصف الأساليب بما في ذلك الاسترداد photobleaching بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) والخسارة في الإسفار Photobleaching (FLIP) لمراقبة ديناميات البروتين في الخلايا الجنينية لونين (ES) الجذعية. ويتعزز لونين ديناميات البروتين ، الذي يعتبر واحدا من الوسائل لدراسة اللدونة لونين ، في الخلاي...

Video: Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

الزخرفة من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام رقاقة بيو فليب

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

سبر للنشاط مجمع الميتوكوندريا في خلايا المنشأ الجنينية البشرية

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

استخدام LysoTracker لكشف موت الخلية المبرمج في الأجنة والخلايا الجذعية الجنينية التفريق

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب<em&gt; القيطم المورق</em&gt; المخاريط النمو

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...