نشكر المعهد الوطني للصحة (1R21CA138373 وانهض لمكافحة السرطان (SU2C) عن الدعم المالي لهذا العمل. HY تشعر بالامتنان للحصول على جائزة Elion 2009 من الجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان ، وهي جائزة الباحث كيميل من مؤسسة سيدني كيميل ل أبحاث السرطان (SKF - 08 - 101) ، وكلية المؤسسة الوطنية للعلوم في وقت مبكر جائزة شهادة (NSF0954819).

1. الاستنساخ اعتبارات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن ligated [أليغنوكليوتيد] أعد تجاريا يمثلون المصالح TMD محاط NheI والمواقع وتقييد BamHI 5&#39; - فسفرته في pTox7 (تعديلها في المختبر لدينا من قبل الإدراج من الزوج قاعدة واحدة مباشرة بعد تقييد موقع BamHI 14) (الشكل 3) هضمها بالتسلسل مع BamHI وNheI. وأبدت قليل النوكليوتيد المثال أدناه : 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &#39; 3 &#39;gTMDSEQUENCEcctag5&#39; </li></ol> وينبغي أن يكون تسلسل TMD 12-24 البقايا (ويفترض أن تكون أقصر متواليات ممدود من قبل مخلفات ناقلات مسعور المشفرة). من أجل التحقيق في الواجهة ، ينبغي إنشاء أربعة أنواع من تصميم انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى الإدراج حيث بقايا متسلسلة ويصاحب ذلك نتيجة مخلفات الحذف في تناوب النسبي لانظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى ToxR. 15،16 وأخيرا ، يجب أن تكون متنوعة وتركز أرابينوز بين 0.001 و 0.01 ٪ (ث / ت) لتحديد تركيز حيث لوحظ اختلاف في أقصى β - غالاكتوزيداز الإشارات بين متواليات TMD مختلفة ؛ اختبار مستويات التعبير المختلفة لتحديد أوصت الشروط التي بموجبها يمكن تمييز الانتماءات المختلفة أفضل. بالإضافة إلى أرابينوز والمضادات الحيوية ، ويمكن استخدام 0.4 ملي IPTG لتعزيز الصلات بين الاختلافات في TMDS مختلفة. وينبغي إجراء قياس ToxR على الأقل في quadruplicate. وينبغي تكرار هذا الإجراء كله ثلاث مرات على الأقل مع التحولات البلازميد مختلفة. 2. نمو الثقافات البكتيرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب بلطف FHK12 الخلايا المختصة (200 ميكرولتر) على الجليد ونقل في أنبوب 15 مل الثقافة. إضافة DNA البلازميد (200 نانوغرام) ، واحتضان الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة صدمة الخلايا الحضانة لمدة 90 ثانية في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، تليها الحضانة على الجليد لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة SOC وسائل الإعلام (800 ميكرولتر) ، واحتضان العينات عند 37 مع اهتزاز (300 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة درجة مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح 5 مل مع وسائل الاعلام LB الكلورامفينيكول (30 ميكروغرام / مل) ، وأرابينوز (0.0025 ٪ ث / ت) مع 50 ميكرولتر من الخليط التحول في 15 مل من أنابيب الثقافة في ثلاث نسخ. احتضان عينات في 37 مع اهتزاز (300 دورة في الدقيقة) لمدة 20 ساعة درجة مئوية (يمكن أن تستخدم بدلا من 5 ميكرولتر من ثقافة لتطعيم 100 ميكرولتر من المتوسطة في لوحة 96 - جيدا. وهذه الطريقة مفيدة عند التعامل مع أعداد كبيرة من العينات ، وعلى الرغم من الأخطاء وسوف يكون أعلى قليلا. ومن أجل تجنب التبخر ، مما سيؤدي للخطأ ، وملء الآبار الأبعد مع وسائل الاعلام ، ولكن لا تستخدمها للحصول على عينات وأخيرا ، انقر نقرا مزدوجا التفاف المشترك بين الغطاء والصفيحة مع parafilm). </li></ol> 3. قياس نشاط β - غالاكتوزيداز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين لوحة قارئ الى 28 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل Z - المخزن في المستودع مع طرف ماصة كبيرة ، مع التأكد من تناول فقط العليا (المائي) طبقة. نقل 100 ميكرولتر من Z-buffer/chloroform الطازجة إلى آبار لوحة 96 - جيدا. نقل 5 ميكرولتر من كل ثقافة في آبار من لوحة في quadruplicate. حذفت الثقافة من أربعة آبار التي ستكون بمثابة فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 595 من لوحة لتحديد كثافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر من 50 Z-buffer/SDS لجميع الآبار من لوحة. تهز القارئ لوحة في لوحة لمدة 10 دقيقة إلى lyze الخلايا. تأكد من الايقاف الخلية واضحة بعد تحلل وكرر الخطوة تهز إذا لزم الأمر. تحلل ناقصة لم يكن يوحي Z-buffer/chloroform الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر الطازجة Z-buffer/ONPG لجميع الآبار وعودة لوحة للقارئ لوحة ، وقياس كل OD 405 ق 30 لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب β - غالاكتوزيداز النشاط باستخدام المعادلة التالية (تذكر لطرح فارغة). ينبغي أن تحسب نسبة OD 405 / دقيقة باستخدام كافة نقاط البيانات في نطاق 405 OD 0،0-1،0 باستخدام تناسب النموذج الخطي. <img src="files/ftp_upload/2721/2721eq1.jpg" alt="المعادلة 1" /> وحدات ميلر تختلف أحيانا عندما سجلت في أيام مختلفة. لذا ، ينبغي أن يقاس بناء مرجعية مثل برنامج العمل العالمي في كل اختبار. ويمكن استخدام قيمها لتطبيع القيم ToxR. </li></ol> 4. الرقابة على التعبير البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الغربية النشاف للتحقق من التعبير حتى بين البنى البروتين. تجمع 50 ميكرولتر ثقافات ثلاث نسخ وأجهزة الطرد المركزي (2000 دورة في الدقيقة ، 4 دقيقة) في microcentrifuge. إزالة طاف بواسطة pipetting وresuspend الكرية المتبقية في المخزن 2 × عينة التحميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 7.5 ميكرولتر على مستوى 8 ٪ هلام وتنفيذ استخدام الاستشراد عند 125 V لل1 دقيقة 5 ساعة. بعد نقل واحتضان مع الضد HRP - مترافق مكافحة MBP وتصور ؛ لوحظ أن البروتين خيالية في حوالي 70 كيلو دالتون مع بعض المنتجات تدهور ينظر أحيانا حوالي 48 كيلو دالتون. ومن الملاحظ أيضا MBP الذاتية في 45 كيلو دالتون (انظر الشكل 5). </li></ol>5. الرقابة على الإدراج غشاء السليم ويستخدم خط خلية من نقص في البروتين ملزمة المالتوز لتقييم المناسبة الإدراج الغشاء من بناء انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى خيالية. عندما نمت على وسائل الاعلام مع الحد الأدنى من المالتوز كمصدر وحيد للكربون ، والخلايا الوحيدة التي تعبر عن غشاء يتجزأ المنتج التعبير مع البروتين الموجود المالتوز ملزمة بشكل صحيح إلى الجبلة المحيطية هي قادرة على النمو. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خلايا PD28 (كما هو موضح لFHK12 الخلايا) وتطعيم 2 مل من المتوسط ​​LB. تنمو الخلايا في 37 مع اهتزاز (300 دورة في الدقيقة) درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 3500 دورة في الدقيقة ، 10 دقيقة ، 4 درجات مئوية ، وأغسلها في برنامج تلفزيوني عن طريق إعادة تعليق (2 مل) من قبل pipetting لطيف مع طرف vortexing كبيرة أو لطيف. بيليه الخلايا (على النحو الوارد أعلاه) ، ويغسل مع برنامج تلفزيوني للمرة الثانية ، وبيليه resuspend أخيرا في برنامج تلفزيوني (1 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 ميكرولتر استخدام الخلايا معلق لتطعيم 5 الحد الأدنى من وسائل الاعلام مل في ثلاث نسخ ، واحتضان مع اهتزاز عند 37 (300 دورة في الدقيقة) درجة مئوية. تأخذ OD 595 قراءات بين 15-25 ساعة ، وتقريبا كل ساعة 2 بواسطة نقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة 96 - جيدا والقراءة باستخدام لوحة قارئ. </li></ol> 6. ممثل النتائج : مثال للاستخدام مقايسة مراسل الترانسكربتي ToxR لتحليل النزعة oligomerization عبر الغشاء في المجالات المبينة في الشكل 4. سبق لدينا التحقيق في oligomerization المجالات عبر الغشاء من multispanning الأغشية لا يتجزأ من البروتين غشاء الكامنة البروتين - 1 (LMP - 1) من خلال تقنيات مختلفة ، من بينها 14 ToxR ظهر المجال عبر الغشاء خمسة (TM5) يحمل نزعة قوية لoligomerize. ويتجلى ذلك من خلال وحدات ميلر عالية وقابلة للمقارنة لرقابة إيجابية ، GPA ، تسلسل راسخة dimerizing. تحور الضارة في TM5 ، D150A ، ويقلل من قدرة تسلسل لoligomerize. LMP - 1 TM1 لا oligomerize كبيرة والمعارض وحدة ميلر منخفضة جدا الإشارة ، مجرد الإشارة أعلاه لفارغة ، وخلايا FHK12 غير المتحول. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. كارتون مسيئة للمقايسة مراسل ToxR. المجال عبر الغشاء (TMD) مدفوعة النتائج oligomerization في dimerization من ToxR وتفعيل النسخ LacZ. الجين المنتج للLacZ ، يمكن كميا β - غالاكتوزيداز كمقياس للميل لانظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى لoligomerize. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 ، وتشطر حلمهي من ONPG بواسطة β - غالاكتوزيداز النتائج في إنتاج أنواع ضوء تمتص س nitrophenolate (ONP). <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. خريطة البلازميد من pToxR7. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. الممثل ToxR مقايسة مراسل الترانسكربتي تحليل الميل oligomerization من البروتين غشاء الكامنة - 1 المجالات عبر الغشاء. المجال عبر الغشاء 5 (TM5) oligomerizes بقوة ، في حين عبر الغشاء المجال 1 (TM1) المعارض سوى التفاعل الضعيف. D150A طفرة في TM5 يقلل بشكل كبير من قدرتها على oligomerize. يتم تضمين برنامج العمل العالمي كتسلسل إيجابية للسيطرة dimerization قوية. يمثل فارغة untransformed FHK12 الخلايا. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. طخة غربية للتعبير البروتين. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. PD28 مقايسة تكامل للسيطرة على غشاء الإدراج الصحيح إلى الجبلة المحيطية. السيطرة السلبية يمثل نقص في بناء البروتين ملزمة المالتوز.

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease.">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li><li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li><li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase.">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li><li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg(2+)-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg(2+)+homeostasis.">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li><li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures.">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li><li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+into+membranes.">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li><li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane.">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li><li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في مقايسة ToxR مراسل الترانسكربتي هو وسيلة سهلة لتحديد تسلسل عبر الغشاء مع احتمال oligomerize. منذ التفاعلات التي تحدث داخل الغشاء الداخلي البكتيرية ، وهذا الاختبار تلتف حول القضايا المرتبطة بصحة نظم الدراسة في بيئات المحاكاة الأغشية. نظرا إلى أن الاستنساخ يمكن بسهولة من TM...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> BamHI تقييد انزيم </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> تم العثور على الانزيمات Invitrogen لتكون أكثر كفاءة من موردين بديلين </td></tr><tr><td> NheI تقييد انزيم </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> تم العثور على الانزيمات Invitrogen لتكون أكثر كفاءة من موردين بديلين </td></tr><tr><td> 15 مل من أنابيب الثقافة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-956 - 1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC وسائل الإعلام </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> تتكون وحدة التخزين المناسبة وتعقيمها قبل التعقيم. </td></tr><tr><td> LB وسائل الإعلام </td><td> سيغما الدريخ </td><td> L7275 </td><td> تتكون وحدة التخزين المناسبة وتعقيمها قبل التعقيم. </td></tr><tr><td> الكلورامفينيكول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> CO 3 78 </td><td> محلول المخزون من 30 ملغ / مل في الإيثانول تخزينها في الفريزر </td></tr><tr><td> أرابينوز </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> محلول المخزون 2.5 ٪ (W / V) في المياه المخزنة في الثلاجة </td></tr><tr><td> غ 2 4 هبو </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> ناه 2 ص 4 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> بوكل </td><td> مالينكرودت كيماويات </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> dodecylsulfate الصوديوم (SDS) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - Nitrophenyl β - D - galactopyranoside (ONPG) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z - العازلة </td><td></td><td></td><td> 16.1 ز نا 2 4 هبو 5.5g ناه 2 ص 4 0.75g بوكل 0.246g MgSO 4 ما يصل إلى 1 لتر ، ودرجة الحموضة 7.0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 مل β - المركابتويثانول ، 2 مل كلوروفورم ، وجعل ما يصل الى 20 مل مع Z - العازلة. دوامة الطرد المركزي : 1 ، 1 دقيقة دقيقة للفي 800 دورة في الدقيقة. جعل كل لوحة جديدة ل. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 ملغ SDS المذاب في 10 مل Z - العازلة </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 ملغ في 10 مل ONPG Z - العازلة. جعل كل لوحة جديدة ل </td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة MBP ريتوكسيماب (HRP مترافق) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> الحد الأدنى من وسائل الاعلام مع المالتوز </td><td></td><td></td><td> 1 × M9 الأملاح والمالتوز 0.4 ٪ ، 1 ملغ / مل الثيامين ، 2 مم MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96 - جيدا لوحة مسطحة القاع </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> لوحة قارئ </td><td> بيكمان كولتر </td><td> DTX880 الكاشف المتعدد </td><td></td></tr><tr><td> ماء الحمام </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> هز الحاضنة </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

رأي التبسيط من المجالات عبر الغشاء البروتين هو مجرد المراسي في طبقات ثنائية فسفوليبيد منذ زمن طويل ثبت بطلانها. في كثير من الحالات تطورت الأغشية التي تغطي البروتينات آليات متطورة للغاية للعمل. 1-3 وإحدى الطرق التي يمكن أن تعدل بروتينات غشاء هياكلها ووظائفها هي عن طريق الاتصال المباشر ومحددة من اللوالب مسعور ، وتشكيل oligomers عبر الغشاء منظم. 4،5 الأخيرة الكثير وقد تركز العمل على توزيع الأحماض الأمينية وجدت في بيئة تفضيلي غشاء مقارنة محلول مائي والقوات بين الجزيئات المختلفة التي تدفع الجمعيات البروتين. 6،7 ومع ذلك ، فإن الدراسات الاعتراف الجزيئية في المجال للبروتينات عبر الغشاء لا يزال متخلفا عن تلك التي للذوبان في الماء المناطق. لا تزال هناك عقبة رئيسية : على الرغم من خصوصية ملحوظة والتي تقارب oligomerization عبر الغشاء يمكن أن يحقق ، 8 القياس المباشر انتماءاتهم ليست هينة. يمكن أن تعوق تطبيق المنهجيات التقليدية لدراسة الغشاء لا يتجزأ من وظيفة البروتين اللاانحلال المتأصلة في متواليات تحت الفحص. يمكن رؤى البيوفيزيائية المكتسبة من دراسة المجالات التي تمثل الببتيدات الاصطناعية عبر الغشاء تقدم نظرة هيكلية مفيدة. ومع ذلك ، شكك في كثير من الأحيان أهميتها البيولوجية للmicellar المنظفات أو أنظمة الحويصلية المستخدمة في هذه الدراسات لتقليد الأغشية الخلوية ؛ لا الببتيدات اعتماد هيكل الأم تشبه في ظل هذه الظروف وسلوكهم الوظيفي لا تعكس حقا طريقة العمل داخل غشاء الأم ؟ تطوير مختبر Langosch لدراسة التفاعلات بين متواليات عبر الغشاء في طبقات ثنائية فسفوليبيد الطبيعية ، والمقايسات ToxR مراسل النسخي. يعبر 9 المجال عبر الغشاء من الفائدة وهو بروتين خيالية مع بروتين ملزمة المالتوز عن الموقع إلى الجبلة المحيطية وToxR تقديم تقرير مستوى oligomerization (الشكل 1). في العقد الماضي ، العديد من المجموعات الأخرى (مثل Engelman ، DeGrado ، شاي) وكذلك تحسين تطبيق هذا الاختبار مراسل ToxR. 10-13 والمقايسات ToxR مختلف اصبحت معيار الذهب لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في أغشية الخلايا. نظهر هنا عملية نموذجية تجريبية أجريت في المختبر لدينا في المقام الأول الذي يلي البروتوكولات التي وضعتها Langosch. هذا الأسلوب ينطبق عموما مفيدة لتحليل الذات عبر الغشاء الجمعيات في مجال E. القولونية ، حيث يتم استخدام β - غالاكتوزيداز الإنتاج لتقييم النزوع oligomerization انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى. TMD المحرض على dimerization ، ToxR بربط المروج CTX مما يصل تنظيم الجينات LacZ لغالاكتوزيداز - β. يتم الحصول على قراءات اللونية التي ONPG إضافة إلى خلايا lyzed. حلمهي تشطر من ONPG بواسطة β - غالاكتوزيداز النتائج في إنتاج أنواع ضوء تمتص س nitrophenolate (ONP) (الشكل 2).

Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

يوصف إجراء فعال لتقييم النزوع oligomerization من المجالات عبر الغشاء المفرد مرور (TMDS). يتم التعبير عن البروتينات خيالية تتكون من انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى لتنصهر في ToxR مراسل سلالة E. القولونية. TMD بفعل أسباب oligomerization dimerization من ToxR ، وتفعيل النسخ وإنتاج البروتين المراسل ، - غالاكتوزيداز.

الميل عبر الغشاء Oligomerization المجال يحدده الفحص ToxR

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

transmembrane-domain-oligomerization-propensity-determined-toxr

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Views.  University of Colorado at Boulder. يوصف إجراء فعال لتقييم النزوع oligomerization من المجالات عبر الغشاء المفرد مرور (TMDS). يتم التعبير عن البروتينات خيالية تتكون من انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى لتنصهر في ToxR مراسل سلالة E. القولونية. TMD بفعل أسباب oligomerization dimerization من ToxR ، وتفعيل النسخ وإنتاج البروتين المرا...

Video: Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

رسم الخرائط البصرية البينية العضلية شبكية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; وإمكانية الغشاء في قلب الأرنب Langendorff perfused-

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

النهج الوراثية والبيوكيميائية ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; تقييم Oligomerization البروتين: دراسة حالة Ryanodine مستقبلات

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

دراسة اندوبلازمية شبكية والميتوكوندريا التفاعلات التي كتبها<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص في خلايا ثابتة

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...