وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من جهاز الاستخبارات الوطنية لYW.CF (AG21068 ، AG31086).

1. الحل تحضير الأنسولين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الأنسولين البقري الطازج حل عن طريق إذابة الانسولين في برنامج تلفزيوني لتحقيق تركيز 0.01 ملغ / مل. يجب أن يبقى كل من الأنسولين / برنامج تلفزيوني وحلول التحكم في برنامج تلفزيوني على الجليد طوال إجراءات الحقن. وينبغي إعداد هذه الحلول مع 0.5 ٪ (V / V) FD &amp; C لم الأزرق. 1 الغذاء التلوين. </li></ol> 2. تحضير وحقن ابرة تعيين المتابعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الإبر الزجاج الشعرية باستخدام الإعدادات التالية puller.The micropipette مجتذب إنتاج الإبر ذات نوعية كافية للحقن : الحرارة ، 345 ؛ السحب ، 210 ؛ السرعة ، 100 ؛ من الزمن ، 200 (100ms). يجب اضعافها الإبر سحبت حديثا عن طريق الضغط على طرف من خلال نسيج Kimwipe. هذه العملية يزيل تصد ممدود غيض مقاومة عالية وتنتج تلميح stouter بقطر أكبر المسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الإبر اضعافها غيض المتابعة في أنبوب يحتوي على الأنسولين microcentrifuge / PBS حل أو برنامج تلفزيوني وحدها. عمل شعري النتائج في ملء الظهير كل إبرة. احتفال رأس الإبرة تحت stereomicroscope لضمان عدم وجود فقاعات الهواء أو الحطام تظهر على الحافة. تجاهل أي الإبر التي لا تملأ نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبر في شغل الإبرة حامل دليل microinjector وموقف حامل الإبرة مع micromanipulator بحيث طرف الإبرة مرئيا من خلال stereomicroscope. تطبيق الضغط الايجابي على عمود السائل في الإبرة التي تحول ميكرومتر microinjector مقبض يدوي تعلق على الغواص على حقنة microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد تم تطبيق تحقق ما يكفي من الضغط لنزوح السوائل عن طريق لمس Kimwipe إلى رأس الإبرة وتؤكد تدفق السوائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم إعداد إبرة للحقن ، لصق مخطط المعايرة على جذع إبرة مع الشريط واضحة ، وجلب رأس الإبرة من خلال التركيز stereomicroscope 20X تحت التكبير. </li></ol> 3. يطير التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم لمدة عشرة أيام عمره الذباب الإناث للتجارب الحقن. جمع الذباب في غضون 24 ساعة من eclosion. تخدير الذباب مع CO 2 مرطب على وسادة الغاز ، ويفرز الذكور والإناث في مكان الذباب قارورة تحتوي على معيار أو نظام غذائي العلاج. الحفاظ على وجبات الذباب الإناث تجريبية لمدة 10 يوما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم العاشر الموالي eclosion والانفصال إلى الوجبات التجريبية ، ونقل الذباب من المواد الغذائية التي تحتوي على قوارير على قارورة تحتوي على المكونات 5 مل من 2 ٪ ، وأغار عليها لتجويع 12-16 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الذباب جوعا على قارورة تحتوي على مرشحات الجلوكوز 10 ٪ ينقع لمدة 1 ساعة قبل حقن الانسولين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير لفترة وجيزة مع الذباب CO 2 مرطب بعد الرضاعة الجلوكوز ويستوقف ثم الباردة لهم على الجليد. </li></ol> 4. الحقن الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم بلطف ذبابة يجمد الباردة مع زوج من ملقط الغرامة والاحتفاظ بها على مقربة من الحافة الإبرة بحيث غيض المتاخمة للمنطقة الأمامية من الجانب الأيسر من الصدر الذبابة. جعل كل طرف الإبرة والصدر الذبابة في التركيز في إطار stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرك بلطف يطير باتجاه رأس الإبرة بحيث يلامس طرف إبرة وسط الناشزة في المنطقة اليسرى من الصدر prescutum الذبابة (الشكل 1). مرة واحدة موجه بشكل صحيح ويطير الانحياز مع طرف الإبرة ، ومواصلة التقدم في الطيران على الإبرة بحيث يخوزق إبرة وسط prescutum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الضغط الايجابي حسب الحاجة من خلال دفع المكبس المحاقن مع مقبض micromanipulator في microinjector حتى تم ضخ 0.1 ميكرولتر من السوائل في الطيران. وتدفق السائل في hemocoel الذبابة إضفاء اللون الأزرق على الجانب الأيسر من الصدر الأمامي. أحيانا لا بد من التراجع والتقدم عدة مرات لإزاحة أي انسداد طرف إبرة والسماح لتدفق السوائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لاسترداد الذباب حقن في قارورة آغار 2 ٪ للحصول على نقاط قبل الوقت المحدد استخراج الدملمف. </li></ol> 5. الدملمف كوكتيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير لفترة وجيزة مع الذباب ثاني مرطب 2 في الوقت المطلوب نقاط بعد الحقن ، وموقف كل جانب الظهرية يطير لأسفل على وجهين الشريط الملصقة على سطح اللوحة 2 CO. ترتيب الذباب في الصفوف حتى مع كبسولات رئيس الانحياز. يمكن للمرء استخدام عصا خشبية لقضيب قلص الصحافة اجنحتها في شريط لاصق ، وضمان عدم الحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إصلاح الذباب على الشريط ، واغتنام كل ذبابة خرطوم ملقط مع الغرامة وسحب برفق تجاه المنطقة البطنية ثم الخلفي للتحرك بحيث الجزء الأمامي من الرأس كبسولة وضوحا من خلال مجهر ستيريو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيدك الأخرى ، وحين يمسك خرطوم في الموقف ، وثقب في وسط رأسه كبسولة فقط فوق الدرز ptilinal باستخدام إبرة حادة التنغستن (الشكل 2). يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم ادخال الإبرة بعيدا جدا لأنه من السهل لكمة غيض من الإبرة من خلال الجانب الآخر من كبسولة الرأس وتفقد في وقت لاحق جontrol تدفق الدملمف. ثقب الذباب كل ذلك في مجموعة الحقن قبل جمع الدملمف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد ثقب كبسولة الرأس ، واستخدام عصا خشبية قلص قضيب لتطبيق الضغط بلطف على بطن الذبابة. قد يكون من المفيد للفة تطير فوق ذلك أنه يعتمد على الجانب البطني وتطبيق الضغط. وسوف ينتج هذا الإجراء بقطرة من الدملمف من ثقب كبسولة موقع الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمسة واحدة من نهاية أنبوب microcapillary 1μl إلى قطرة الدملمف الناشئة من موقع رئيس ثقب كبسولة. سوف الدملمف أدخل أنبوب عبر العمل الشعري. تحديد وتسجيل كمية الدملمف جمعها عن طريق التحقق من عمود السائل داخل الأنبوب microcapillary ضد مخطط حجم تخرج. </li></ol> 6. الدملمف الجلوكوز تقدير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج عينات الدملمف microplate في الآبار التي تحتوي على 100 ميكرولتر من الجلوكوز الكاشف إنفينيتي. إبقاء لوحة على الجليد أثناء تحميل عينات الدملمف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء منحنى القياسية عن طريق تحميل كل على حدة 1 ميكرولتر من الحلول الأسهم الجلوكوز في 50mM ، 25mM ، 6.25mM ، و12.5mM 3.125mM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عينات في 37 دقيقة لمدة 10 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف الامتصاصية في 340 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب حجم الدملمف جمع العينات وتحديد تركيز الغلوكوز استنادا إلى منحنى القياسية مع تركيز الجلوكوز معروفة. </li></ol> 7. ممثل النتائج تم الكشف عن التسامح الانسولين استجابة نموذجية في الذباب ، حقن الانسولين حيث تم الكشف عن انخفاض مستويات السكر في تعميم 15 دقيقة بعد الحقن. في المقابل ، لا ينظر إلى مثل هذه الاستجابة في الذباب PBS حقن (الشكل 3). هذا الرد في التخلص من الغلوكوز المحيطي يستمر في حقن الانسولين الذباب ، يصل إلى 30 دقيقة بعد الحقن. نخرج بصورة روتينية 0،2-0،5 ميكرولتر من الدملمف 4-5 في الذباب في كل مجموعة الحقن. وشملت مجموعات ضخ ثلاثة في كل تجربة. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. الجانب الأيسر من الصدر ذبابة الفاكهة تظهر الإبرة موقع الإدراج (تم التعديل من Demerec ، 1950) 7. أدخل الإبرة من خلال مركز prescutum على المنطقة ، الظهرية الأمامية من الجانب الأيسر من الصدر. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. عرض أمامي لرأس ذبابة الفاكهة تبين موقع البزل لاستخراج الدملمف (معدلة من Demerec ، 1950) 7. ثقب كبسولة الرأس مع التحقيق الذي تجريه التنغستن شحذ ناعما في وسط الكبسولة الرأس فقط فوق الدرز ptilinal. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. التسامح والانسولين استجابة نموذجية في الكشف عن سيطرة الكبار الذباب. تم حقن السيطرة الذباب ث 1118 مع الانسولين البقري (1 نانوغرام في برنامج تلفزيوني) ، أو برنامج تلفزيوني فقط. ثم سمح الذباب في مجموعات لاسترداد نسخ دقائق 0 ، 15 أو 30 ومستويات السكر في تعميم تم قياسه.

<ol>
	<li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1118 (2002).</li><li>Kim, S. K., Rulifson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+glucose+sensing+and+regulation+by+Drosophila+corpora+cardiaca+cells.">Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells.</a> Nature. 431, 316-316 (2004).</li><li>Broughton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longer+lifespan,+altered+metabolism,+and+stress+resistance+in+Drosophila+from+ablation+of+cells+making+insulin-like+ligands.">Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).</li><li>Haselton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+ablation+of+adult+Drosophila+insulin-producing+neurons+modulates+glucose+homeostasis+and+extends+life+span+without+insulin+resistance.">Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance.</a> Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).</li><li>Haselton, A. T., Fridell, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+the+study+of+glucose+homeostasis.">Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis.</a> Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).</li><li>Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+insulin+pathways+alters+trehalose+level+and+abolishes+sexual+dimorphism+in+locomotor+activity+in+Drosophila.">Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila.</a> J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).</li><li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Drosophila. , (1950).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تقنية وصفها في هذا التقرير قد تكون مفيدة في أي دراسة العمليات الفيزيولوجية التي تحقق مما أدى إلى اكتشاف تغيرات في تركيبة الدملمف ذبابة الفاكهة. من خلال الجمع بين الحقن وجمع الدملمف بهذه الطريقة ، فمن الممكن للتأكد من الآثار المباشرة ذات الصلة من الناحية الفسيول...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف / المعدات </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> الأنسولين البقري </td><td> سيغما </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> اللانهاية الجلوكوز الكاشف </td><td> شركة الكترون الحرارية </td><td> TR1541 </td></tr><tr><td> دليل microinjector </td><td> سوتر الصك </td><td></td></tr><tr><td> P - 87 Flamming / براون micropipette مجتذب </td><td> سوتر الصك </td><td></td></tr><tr><td> برميل واحد من الزجاج البورسليكات الشعرية </td><td> نظم AM </td><td> 626000 </td></tr><tr><td> FD &amp; C الأزرق رقم (1) </td><td> ماكورميك آند كومباني </td><td></td></tr><tr><td> 1 أنابيب microcapillary ميكرولتر </td><td> دروموند </td><td></td></tr><tr><td> ثلاثة محاور micromanipulator اليدوية والقاعدة </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td></td></tr></tbody></table>

insulin injection and hemolymph extraction to measure insulin sensitivity in adult drosophila melanogaster

حفظ المواد الغذائية آليات الاستشعار الموجودة بين الثدييات وذبابة الفاكهة التي تشبه الببتيدات الانسولين والجلوكاجون الثدييات ، على التوالي وظيفة للحفاظ على توازن السكر في خلال مراحل النمو 1،2 اليرقات. وقد كشفت الدراسات عن الذباب الكبار إلى حد كبير بعد الإنقسامية من اضطراب توازن الجلوكوز نتيجة الاجتثاث الوراثية للأنسولين مثل الببتيد (ILP) الخلايا المنتجة (IPCS) 3. وهكذا ، ذباب الفاكهة الكبار على وعود كبيرة كنظام نموذج مناسب لالوراثية الاضطرابات الأيضية بما فيها النوع الثاني من السكري. لمزيد من تطوير نظام ذبابة الفاكهة ، يجب وضع المقايسات الفسيولوجية للمقارنة المستخدمة لقياس تحمل الغلوكوز والحساسية للانسولين في الثدييات. لهذا الغرض ، وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة إجراء الرواية الشفوية لقياس استجابة التسامح الجلوكوز في الطيران الكبار وأظهرت أهمية IPCS الكبار في الحفاظ على توازن السكر في 4،5. هنا ، قد عدلت أننا إجراء سبق وصفها للحقن الانسولين (6) ودمجتها مع طريقة استخراج الدملمف رواية لقياس حساسية الإنسولين الطرفية في الطيران الكبار. فريد ، لدينا بروتوكول يسمح القياسات الفسيولوجية المباشر على قدرة الطيران الكبار للتخلص من حمولة الجلوكوز الطرفية عند حقن الانسولين ، والمنهجية التي تجعل من الممكن لتوصيف المسوخ الانسولين مما يشير والتدخلات المحتملة التي تؤثر على تحمل الغلوكوز وحساسية الانسولين في الطيران الكبار.

Watch this Scientific Journal Video about Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster at JoVE.com

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

العثور على مسارات الحفظ إشارات الانسولين في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; جعل هذا الكائن أداة محتملة للنمذجة الاضطرابات الأيضية بما فيها النوع الثاني من السكري. تحقيقا لهذه الغاية ، من المهم جدا لإنشاء المقايسات الفسيولوجية لقياس فعالية المنهجية عمل الانسولين في التخلص من الغلوكوز في محيطي يطير الكبار.

حقن الانسولين واستخراج الدملمف لقياس حساسية الانسولين في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

insulin-injection-hemolymph-extraction-to-measure-insulin-sensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

19.6K Views.  State University of New York. العثور على مسارات الحفظ إشارات الانسولين في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن جعل هذا الكائن أداة محتملة للنمذجة الاضطرابات الأيضية بما فيها النوع الثاني من السكري. تحقيقا لهذه الغاية ، من المهم جدا لإنشاء المقايسات الفسيولوجية لقياس فعالية ا?...

Video: Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

تشريح Oenocytes من الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

والفحص الكمية للأنسولين ، معربا عن الأسلاف لتشكيل مستعمرة

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

استخدام رامزي الفحص لقياس إفراز السوائل وايون الجريان الاسعار في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; الأنبوب الصغير مالبيغي

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

قياس امتصاص الجلوكوز والاستجابة لتحفيز الأنسولين في<em&gt; في المختبر</em&gt; مثقف الإنسان ميوتوبيس الابتدائية

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight muscles (IFMs) of flies, specifically the dorso-longitudinal muscles (DLM), as the experimental subject to measure the atrophic phenotype brought about by different genetic causes. In this protocol, we describe how to embed fly thorax muscles for semi thin sectioning, how to obtain a good contrast between muscle and the surrounding tissue, and how to process optical microscope images for semiautomatic acquisition of quantifiable data and analysis. We describe three specific applications of the methodological pipeline. First, we show how the method can be applied to quantify muscle degeneration in a myotonic dystrophy fly model; second, measurement of muscle cross-sectional area can help to identify genes that either promote or prevent muscle atrophy and/or muscle degeneration; third, this protocol can be applied to determine whether a candidate compound is able to significantly modify a given atrophic phenotype induced by a disease-causing mutation or by an environmental trigger.

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

We report a method to quantify muscle area, which is an indirect method to determine muscle mass in Drosophila adults. We demonstrate the application of our methodology by analyzing the indirect flight muscles in a Drosophila model of Myotonic Dystrophy disease.

تحديد منطقة عضلة مستعرضة الضوئية عضلات الطيران غير المباشر الكبار Melanogaster المورفولوجية

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

This protocol describes methods to orally expose and infect the fruit fly Drosophila melanogaster with bacterial pathogens, and to measure the number of infectious bacteria shed following gut infection. We further describe the effect of immune mutants on fly survival following oral bacterial infection.

شفوي من العدوى البكتيرية وإلقاء في melanogaster المورفولوجية

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...