يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتنظيم الوراثي لتكوين وصيانة حاجز الدم في الدماغ خلال مراحل متعددة من تطور دروسوفيليا. ويمكن أيضا أن تتكيف هذه الطريقة لدراسة نفاذية الحواجز الأخرى، مثل ظهارة المعوية في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم وظيفة حاجز الدم في الدماغ في الأنسجة الحية.
العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية، حيث أن معالجة العينات قد تكون صعبة وتتطلب العديد من الخطوات الانتباه إلى التفاصيل. لجمع الأجنة مكان ما لا يقل عن 50 الإناث العذراء مع 20 إلى 25 الذكور في زجاجة مع الذرة وجبة أجار الغذاء واحتضان هذه الذباب لمدة يوم إلى يومين قبل بدء المجموعات. في اليوم السابق لجمع، وصحائح عصير التفاح الدافئة أجار في 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي نقل الذباب المهذب ثاني أكسيد الكربون إلى قفص جمع ووضع قبل تسخين عصير التفاح أجار لوحة مع مسحة صغيرة من معجون الخميرة على الطرف المفتوح من القفص. ثم تأمين لوحة إلى القفص مع الأكمام الحمراء. لمسح الأجنة القديمة، والسماح للذباب لوضع البيض على طبق عصير التفاح أجار لمدة ساعة واحدة في 25 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، عكس الجانب شبكة قفص أسفل والاستفادة من الذباب إلى أسفل القفص. استبدال عصير التفاح أجار مع جديد قبل الدافئة عصير التفاح أجار لوحة مع مسحة صغيرة من معجون الخميرة. السماح للذباب لوضع البيض على لوحة جديدة لمدة ساعة أخرى في 25 درجة مئوية.
لجمع أواخر المرحلة 17 أجنة للحقن، استبدال لوحة عصير التفاح أجار مع لوحة جديدة قبل الدفء مع مسحة من معجون الخميرة. والسماح للذباب لوضع البيض على لوحة في 25 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة، استبدل الطبق وعمره بالأجنة التي تم جمعها لمدة 19 ساعة عند 25 درجة مئوية بحيث يكون عمر الأجنة من 20 إلى 21 ساعة في وقت التصوير.
في نهاية الحضانة لمدة 19 ساعة ، قم بإزالة لوحة جمع الأجنة من الحاضنة وتغطي سطح اللوحة بـ PbTx. استخدم فرشاة طلاء لتخفيف الأجنة من سطح اللوحة إلى مصفاة شبكة نايلون 70 ميكرومتر. ووضع المصفاة مع الأجنة في محلول تبييض 50٪في طبق بيتري 100 ملليمتر لمدة خمس دقائق مع الانفعالات في بعض الأحيان في درجة حرارة الغرفة لتقتيحها.
في نهاية الحضانة ، شطف الأجنة ثلاث مرات عن طريق تدوير المصفاة في PbTx الطازجة ، وذلك باستخدام طبق بيتري جديد لكل غسل. غسل الأجنة إلى جانب واحد من مصفاة مع PbTx واستخدام ماصة زجاجية لنقل الأجنة على لوح جل agarose 2٪. إزالة السائل الزائد مع ورقة مرشح.
محاذاة ستة إلى ثمانية أجنة على لوح مع الخلفيات إلى اليمين والجانبين الظهرية التي تواجه والضغط بحزم على قطعة من الشريط على الوجهين الملصقة على شريحة على رأس الأجنة. ثم اضاح الأجنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة قبل تغطية العينات بزيت الهالوكربون. لجمع اليرقات ، قم بإعداد صليب مع 5 إلى 10 ذباب أنثى عذراء من النوع الجيني المطلوب ونصف عدد الذكور من النمط الجيني المطلوب في قارورة مع طعام كورند اجار.
بعد خمسة إلى سبعة أيام في 25 درجة مئوية ، اعتمادا على النمط الجيني ، واستخدام ملقط لجمع بلطف تجول اليرقات الثالثة من القارورة وشطف اليرقات مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي طعام عالق. نقل اليرقات إلى طبق عصير التفاح agar لgenotyping حسب الضرورة قبل استخدام فرشاة الطلاء لتجفيف اليرقات على الأنسجة. ثم استخدم ملقط لنقل ست إلى ثماني يرقات إلى شريحة معدة بشريط مزدوج الوجه.
قبل الحقن، استخدم جرة ميكروبيبيت لسحب أنابيب الشعيرات الدموية إلى شكل إبرة قياسية لحقن D.Melanogaster ورسو الإبر في الطين في طبق بيتري. لحقن الجنين، استخدم 20 ميكرولتر هلام تحميل ماصة تلميح لتحميل إبرة معدة مع 5 ميكرولترات من 10 كيلودالون dextran مترافق إلى sulforhodamine 101 كلوريد حمض وتحميل الإبرة في حامل إبرة. ضع الإبرة في ميكرو مانانيبولاتور مضمونة إلى قاعدة فولاذية وتعيين جهاز الحقن إلى 50 رطلًا في البوصة المربعة و5 إلى 10 مللي ثانية مع نطاق 10.
ضع الشريحة على مرحلة micromanipulator وفرشاة حافة الإبرة ضد حافة الشريط على الوجهين في زاوية 45 درجة لخلق طرف زاوية قليلا مكسورة فقط بما يكفي للسماح تدفق dextran 10 كيلودالون من خلال فتح. ضخ دواسة القدم حتى الصبغة في طرف الإبرة. محاذاة الإبرة بحيث تكون متوازية مع الجنين وثقب الطرف الخلفي للعينة.
ضخ دواسة القدم لحقن اثنين من نانولترات من صبغ في العينة. لاحظ وقت الحقن لأغراض الحضانة والاستمرار في أسفل الشريحة لحقن عينات إضافية. لحقن اليرقات، جعل فتحة الزاوية أكبر قليلا من تلك التي تستخدم لحقن الأجنة وزاوية الإبرة قليلا إلى أسفل نحو العينة قبل حقن اليرقات مع 220 نانولترات مماثلة لما هو موضح للعينات الجنينية.
في نهاية حضانة الحقن لمدة 10 دقائق ، استخدم قضيبًا مقلوبًا من القطن لتطبيق الهلام البترولي على الجانبين الأيمن والأيسر للعينات على الشريحة كمسافة. ضع الغطاء على القمة وضعه على مرحلة المجهر confocal. حدد الهدف 20X وصورة العينات في جميع أنحاء عمق كل جنين.
ثم حساب النسبة المئوية للعينات مع حاجز الدم في الدماغ للخطر وفقا للصيغة. قبل البدء في إجراء التشريح ، استخدم طلاء الأظافر لتركيب زلتين تغطيتين متباعدتين تقريبًا 0.5 سنتيمترًا على شريحة ووضع يرقة حقن في PBS على الشريحة في نهاية الحضانة لمدة 30 دقيقة. باستخدام زوج واحد من ملقط، فهم اليرقة في منتصف الطريق أسفل الجسم اليرقة واستخدام زوج ثان من ملقط لفصل النصفين الأمامي والخلفي من اليرقة.
بعد ذلك، استخدم زوجاً واحداً من ملقط لقبضة المنطقة الأمامية على خطاطيف الفم واستخدم الزوج الثاني من ملقط لعكس جدار الجسم على طرف أول زوج من ملقط. المخ والحبل العصبي البطني سيُكشفان فصل الدماغ والحبل العصبي البطني من جدار الجسم عن طريق قطع الأعصاب إذا لزم الأمر وإزالة جدار الجسم من الشريحة.
تغطية العينة مع 10 ميكرولترات من 80٪ الجلسرين. ثم ضع زلة غطاء فوق العينة للتصوير وصورة العينات لتحديد النسبة المئوية للعينات التي بها حاجز دموي مخترق كما هو موضح. عندما يتم حقن نوع البرية المرحلة المتأخرة 17 مع 10 كيلودالون ديكستران مترافق إلى sulforhodamine 101 حمض كلوريد صبغة الفلورسنت، يتم استبعاد جزيء ديكستران كبيرة من الحبل العصبي البطني، كما هو متوقع.
هيتروزيجوس الخام 1 الأجنة متحولة يحمل حاجز الدم في الدماغ سليمة، على غرار تلك التي لوحظت في أنواع البرية السيطرة على الأجنة. في المقابل، تظهر الأجنة المتحولة المهووسة 1 عيوبًا في سلامة حاجز الدم في الدماغ، مع تدفق ديكستران 10 كيلودالتون في الحبل العصبي البطني، مما يشير إلى فشل حاجز الدم في الدماغ في التشكل. في عينات اليرقات من النوع البري ، يفشل 10 كيلودالون ديكستران في اختراق حاجز الدم في الدماغ ويتم استبعاده من الدماغ والحبل العصبي البطني.
عند محاولة هذا الإجراء، الشيخوخة السليمة للأجنة أمر بالغ الأهمية لضمان فحص العينات في سن التي من المتوقع أن تكون كاملة تشكيل حاجز الدم في الدماغ. بعد هذا الإجراء، يمكن زيادة دراسة المسوخ الذين يظهرون حاجزًا دمويًا مخترقًا باستخدام علم الوراثة والكيمياء المناعية والمجهر لفهم وظيفة الجينات على المستوى الخلوي بشكل أفضل. وستتيح هذه التقنية للباحثين تحديد جينات إضافية تعتبر حاسمة لإنشاء وصيانة حاجز الدم في الدماغ.
