يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في نقل الخلايا بالتبني من الخلايا T المُستضدات الفيروسية المشتقة من iPSC من أجل الكبت الفعال لتكرار HBV في الفئران. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا التائية الفيروسية المشتقة من المستضدات الفيروسية iPSC لديها مستقبلات خلية T من نوع واحد ونمط ظاهري ساذج. للتمايز من HBV محددة iPSC CD8 إيجابية الخلايا T, لوحة s183 T مستقبلات الخلايا الجينات التي تورث iPSCs على monolayer OP9-DL1/DL4 في الحد الأدنى من المتوسط ألفا تكملها 20٪ مصل البقر الجنيني وmerine Flt3 ligand لثقافة المشتركة في حاضنة ثقافة الخلية.
مراقبة الثقافة المشتركة بانتظام لتقييم مورفولوجيا الخلية. في اليوم 28، قم بإزالة الخلايا الطافية والعائمة، وافصل الخلايا المنضمة بنسبة 0.25٪التربسين. عندما تكون الخلايا قد رفعت من أسفل حاوية الثقافة، ووقف رد فعل انزيمية مع ثمانية ملليلتر من المتوسط iPSC، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
Resuspend بيليه في 10 ملليلتر من المتوسطة الطازجة. تمييع الخلايا إلى خلية T إيجابية CD8 مشتقة من iPSC إلى أربعة نسبة طحالية الببتيد النبضية إلى أربعة من الببتيد النبضية لمدة 40 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. خلال الساعات السبع الماضية، إضافة أربعة ميكرولترات من brefeldin المخفف ألف إلى الثقافة، لمنع عمليات النقل أثناء تنشيط الخلية.
وصمة عار الخلايا لتحليل تدفق السيتوكينات الخلوية داخل الخلايا من الفائدة وفقا للبروتوكولات القياسية. لhdynamic HBV plasmid التسليم من خلال الوريد الذيل، وتمييع 10 ميكروغرام من بلاسمد HBV في ما يعادل 8٪ من كتلة الجسم من برنامج تلفزيوني. قم بتحميل البلازميد في حقنة واحدة من ثلاثة ملليلتر مجهزة بإبرة قياس 26 بوصة لكل فأرة.
سخني فئران HHD تحت مصباح حراري لمدة خمس دقائق لتمدد عروق الذيل، وسحب فأر بعناية إلى مقيّد بلاستيكي. تحديد موقع الوريد الذيل الجانبي المتوسعة في الثلث الأوسط من الذيل، وإدراج إبرة موازية للورد لتقديم كامل حجم البلازميد من خلال الوريد الذيل على مدى فترة من ثلاث إلى خمس ثوان. بالنسبة لـ iPSC المشتقة من CD8-positive T cell المشتقة من CD8، قم بجمع خلايا T CD8 إيجابية iPSC في اليوم 22 من الثقافة كما هو موضح، وبذّر الخلايا على طبق ثقافة خلية جديد طوله 10 سنتيمترات.
بعد 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية ، قم بتصفية الخلايا العائمة من خلال مصفاة نايلون 70 ميكرومتر ، واحسب الخلايا القابلة للحياة. تمييع الخلايا إلى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر من تركيز برنامج تلفزيوني. حقن 200 ميكرولتر من الخلايا في الفردية أربعة إلى ستة أسابيع فئران HHD القديمة، في الوريد الذيل كما هو موضح للتو.
في اليوم 14 بعد نقل الخلايا، تنفيذ تسليم بلاسميد HBV هيدرودينامية كما هو موضح. وعند نقاط النهاية التجريبية المناسبة بعد العدوى، حصد الكبد من كل مصاب، وقطع الكبد إلى عينات أنسجة 0.5 في 0.5 في 0.3 سنتيمتر. ضع العينات في 10٪ من الكالين المحايد لمدة أربع إلى 24 ساعة ، تليها إزالة النسل في حمض الفورميك 2.5-molar لمدة ست إلى 24 ساعة.
بعد ذلك ، شطف العينات في إكسيلين لمدة ثلاث دقائق ، تليها اثنين من الشطف لمدة دقيقتين في الإيثانول 100 ٪ ، 95 ٪ الإيثانول ، والماء الأيونية. بعد غسل المياه الأخير ، قم بتخميم الأنسجة في EDTA من الملليمتر الواحد عند 90 درجة مئوية ، تليها حضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عندما يبرد النسيج، شطف العينات في برنامج تلفزيوني لمدة أربع دقائق، واستخدام الزيلين والإيثانول ل deparaffinize وإعادة هيدرات العينات.
لوضع العلامات المناعية، وصمة المقاطع مع 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة المضادة لسطح HBV محددة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطب 75 إلى 100٪. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع خمسة يغسل لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. تسمية الخلايا مع DAPI وفقا للبروتوكولات القياسية قبل تركيب الشرائح مع الأغطية للتصوير عن طريق المجهر الفلوريس.
للتحليل المناعي الكيميائي، وصمة عار الأقسام مع الهماوكسيلين ويوسين وفقا للبروتوكولات القياسية، وتقييم تسلل الخلايا الالتهابية في الكبد عن طريق المجهر الخفيفة. تحليل تدفق cytometric من iPSC المستمدة CD3 إيجابية CD8-positive السكان يكشف أن HBV T مستقبلات الخلايا نقل يزيد بشكل كبير من توليد الخلايا التائية S183-محددة CD8 الفيروسية. بعد التحفيز مع الطحال المنضب T نبض مع الببتيد s183, CD4-السلبية CD8 أحادية الإيجابية iPSC المشتقة الخلايا التائية تنتج كميات كبيرة من الانفيرون غاما, كما كشفها التحليل الخلوي تدفق داخل الخلايا و ELISA.
بعد عدوى HBV عن طريق الحقن الهيدروديناميكية، يبلغ تكرار الحمض النووي ذروته في اليوم السادس ويقلل تدريجياً، كما لوحظ من خلال تحليل PCR في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يتم تخفيض النسخ الفيروسي بشكل كبير في جميع النقاط الزمنية في الفئران التي تتلقى خلايا T المضادة للحساسية الفيروسية HBV مقارنة بالفئران التي تتلقى خلايا التحكم. كما ينخفض بروتين سطح HBV بشكل كبير في الفئران التي تتلقى HBV فيروسية مستضد محددة قبل iPSC الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا مقارنة بالفئران المعالجة بالخلايا التحكمية، مما يدل بوضوح على أن الخلايا التائية iPSC CD8-positive-antigen الفيروسية الفيروسية لديها القدرة على تقليل تكرار HBV في نموذج مورين.
يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية توليد الخلايا التائية المضادة للفيروسات من iPSC للعلاج المناعي بالتبني.
